TLR4 在腦出血繼發(fā)性損傷中腦水腫形成的

TLR4在腦出血繼發(fā)性損傷中腦水腫形成的炎性機制研究

一、實驗背景及意義

二、實驗研究內(nèi)容

三、實驗方法及技術(shù)

四、實驗可行性分析

五、實驗預期結(jié)果

六、實驗進展

七、實驗經(jīng)費預算

八、參考文獻實驗背景及意義腦出血后繼發(fā)性損傷腦水腫形成是多種機制的綜合結(jié)果，其中炎性損傷機制備受矚目[3,4]，各種炎性細胞的激活，細胞因子、炎性遞質(zhì)的釋放，共同造成或加重繼發(fā)性腦損傷[5]。研究說明炎性反響與腦水腫有著密切聯(lián)系：炎性反響是腦水腫形成的重要原因[6,7]。目前在炎癥免疫反響的研究領域里，Toll樣受體家族〔Toll-likeReceptors,TLRs〕是眾多學者的關(guān)注熱點，其屬于跨膜信號轉(zhuǎn)導受體家族，通過感知病原微生物存在，轉(zhuǎn)導細胞的炎性信號，參與多細胞生命體古老的防御機制，是連接先天免疫和特異性免疫的紐帶。TLR4參與腦缺血再灌注損傷已被實驗所證[16,17,18]，TLR4激活炎性反響是缺血性卒中后腦水腫形成的重要環(huán)節(jié)。Cao等[16]采用大鼠大腦中動脈線栓模型,研究發(fā)現(xiàn)腦缺血6h再灌注24h后,無論是腦水腫程度、腦梗死體積,還是神經(jīng)元損傷程度,TLR4缺陷的小鼠都明顯低于野生型,并且TNF-α和IL-6水平降低,認為腦缺血再灌注后TLR4缺陷的小鼠可能通過抑制炎性細胞的激活,下調(diào)炎性細胞因子的產(chǎn)生來減少炎癥反響,從而減輕損傷程度。其實腦出血后血腫周圍也存在缺血現(xiàn)象[19]，出血性卒中與缺血性卒中的損傷機制在某種程度上有著共性。但TLR4是否參與腦出血后繼發(fā)性損傷,是否通過介導炎性機制在腦水腫形成的病理生理演變過程中發(fā)揮作用,至今尚不清楚。水通道蛋白4(Aquaporin4,AQP4)是焦點，作為一種與水通透有關(guān)的細胞膜轉(zhuǎn)運蛋白，影響水跨膜轉(zhuǎn)運和調(diào)節(jié)細胞內(nèi)外環(huán)境平衡。在正常腦組織中主要分布于鄰近毛細血管壁的星形膠質(zhì)細胞足突上和腦室周圍的室管膜細胞，成為水在細胞、血管和腦室移動的關(guān)鍵部位[20]。星形膠質(zhì)細胞瘤中AQP4表達明顯上調(diào),并與腦水腫程度、血腦屏障的開放有顯著的相關(guān)性[21]。多種腦水腫實驗模型均顯示AQP4在腦水腫的發(fā)生開展中扮演重要角色[22，23]。實驗說明：炎性反響可上調(diào)AQP4的表達。在過敏原和IL-13誘導的哮喘小鼠模型中[24],炎性反響顯著，基底膜側(cè)的AQP4表達上調(diào)是特征性的改變。AQP4在實驗性自身免疫腦脊髓炎模型的腦皮質(zhì)和脊髓中表達也上調(diào)[25],提示AQP4可能與急性期炎癥的開展相關(guān)。張新宇等[26]通過在大鼠腦內(nèi)微量注射炎性因子TNF-α后，發(fā)現(xiàn)早期就可出現(xiàn)腦水腫，并測得AQP4明顯上調(diào)、血腦屏障通透性顯著增加，且二者成顯著正相關(guān)。因此，炎性因子誘發(fā)腦水腫的機制可能是：通過多種途徑破壞血腦屏障，繼而誘導AQP4表達上調(diào)，進一步加重腦水腫，形成惡性循環(huán)。進而推測：TLR4作為炎性信號通路轉(zhuǎn)導受體，激活下游強有力的炎性級聯(lián)反響，介導炎性損傷,極有可能也通過誘導AQP4表達上調(diào),參與腦水腫形成。但目前，國內(nèi)外缺乏此方面的研究。實驗研究內(nèi)容本課題采用大鼠尾狀核立體定向注射自體血模型，研究TLR4是否通過介導炎性反響，上調(diào)AQP4表達參與腦出血后腦水腫形成，探索TLR4在腦出血繼發(fā)性損傷中腦水腫形成的炎性機制。具體內(nèi)容：1、從基因分子水平，研究時間演變過程中TLR4mRNA、TNF-αmRNA表達與AQP4mRNA表達、腦出血后腦水腫程度的相關(guān)性。2、并與蛋白、細胞水平結(jié)合，研究腦出血損傷后TLR4、TNF-α與AQP4在時空上的變化及聯(lián)系。實驗方法1、實驗動物及分組實驗一：65只SD大鼠將其隨機分為手術(shù)組(A1組，n=30)、假手術(shù)組(B1組，n=30)、空白對照組(C1組，n=5)。A1組和B1組按手術(shù)后處死的時間再分為1h組、6h組、24h組、72h組，5d組，7d組，每組各為5只。在相應的時間點處死大鼠后測量大鼠腦的含水量、腦組織TLR4mRNA、TNF-αmRNA、AQP4mRNA的表達測定。實驗技術(shù)2腦組織標本的采取:實驗一：在各時間點將大鼠麻醉后斷頭取腦，以腦血腫處為界，將腦組織分為前半部、后半局部。前半部用于腦含水量的測定；后半部用于TLR4mRNA、TNF-αmRNA、AQP4mRNA的測定。實驗二：術(shù)后在相應時間點乙醚麻醉動物,從左心室插管至主動根部，生理鹽水快速灌注之后，多聚甲醛快速灌注固定，斷頭取腦,以注射針道為中心做冠狀切片,厚度約5mm.標本按常規(guī)程序制成厚度5μm的石蠟切片。相鄰切片分別行HE染色病理觀察、及TLR4、TNF-α、AQP4免疫組化檢測實驗技術(shù)3腦含水量的測定：取每只大鼠右側(cè)大腦半球穿刺點前半部的腦組織分別稱重(濕重)，然后置入100℃恒溫烤箱中，24h后取出再稱重(干重)。以(濕重－干重)／濕重×100％計算腦含水量，以此代表腦水腫的程度。實驗技術(shù)4免疫組化法檢測冠狀腦切片TLR4、TNF-α、AQP4蛋白水平及對腦組織行RT-PCR分析TLR4、TNF-α、AQP4。實驗可行性分析〔一〕承擔單位概況(人員、資產(chǎn)、業(yè)務與管理狀況)在相關(guān)國內(nèi)外研究的根本動態(tài)和技術(shù)的根底上，我們具有一批能夠參與該方面研究的人員。本課題組成員對相關(guān)學科的實驗技術(shù)熟練，實驗方法可靠，可重復性強，并已進行一些前期的研究，取得了初步經(jīng)驗。另外，申報單位具有國家重點實驗室的平臺，其實驗設備與技術(shù)完全能滿足該工程的需要。因此，探索腦出血繼發(fā)性損傷機制，尋找炎性信號轉(zhuǎn)導治療靶點，我們認為從研究人員，到研究技術(shù)和研究條件都具有可行性。實驗可行性分析〔二〕本工程現(xiàn)有的研究工作根底(包括現(xiàn)有科研裝備條件)我院呼吸疾病國家重點實驗室已具備了動物造模、RT-PCR、免疫組化等實驗技術(shù)的所需設備：動物頭顱立體定位儀(SN-2,NARISHIGE，日本)、電子分析天平(BP211D，塞多利斯，德國)、PCR熱循環(huán)儀〔日本Techne公司〕、全自動紫外分光光度儀〔美國PerkinElmer公司〕、電泳凝膠圖像分析儀〔上海Tanon公司〕、高速低溫離心機〔德國Universal公司〕、電泳儀(PowerPacBasic,BIO一RAD，美國)、石蠟切片機(德國LeicaRM-2135)、光學顯微鏡(日本Olympus)、顯微鏡攝像系統(tǒng)(日本Olympus)等。該國家重點實驗室及我院病理科可為實驗提供有力的技術(shù)支持。實驗預期結(jié)果1腦出血后TLR4作為炎性信號通路轉(zhuǎn)導受體，激活下游強有力的炎性級聯(lián)反響，通過誘導AQP4表達上調(diào),參與腦水腫形成。2TNF-α通過誘導AQP4表達上調(diào)，參與腦出血后腦水腫的形成。實驗進展起止時間主要工作內(nèi)容2021年10月-2021年12月實驗前期準備，定購試劑、耗材、大鼠，預實驗。2021年1月-2021年3月完成實驗一：手術(shù)造模、依各時間點腦組織取材，測定腦含水量、RT-PCR方法測定TLR4mRNA、TNF-αmRNA、AQP4mRNA的表達。2021年4月-2021年6月完成實驗二：手術(shù)造模、依各時間點腦組織取材，冠狀腦切片行HE染色病理觀察，免疫組化法檢測TLR4、TNF-α、AQP4蛋白。2021年6月-2021年7月整理數(shù)據(jù)，統(tǒng)計分析。2021年7月-2021年10月撰寫論文、投稿。實驗經(jīng)費預算1、專用業(yè)務費：1〕標本、樣品采集加工費：5000元2〕測試費：6500元3〕試驗動物養(yǎng)殖費：250×2×7=3500元4〕其他〔管理費、協(xié)作費、勞務費、論文版面費〕：5000元2、原材料費：1〕RT-PCR試劑〔Trizol、DEPC、DNaseⅠ、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、微量加樣槍、TLR4、TNF-α、AQP4及內(nèi)