濁點萃取-異辛烷反萃取-氣相色譜法測定茶葉中6種擬除蟲菊酯農(nóng)藥

濁點萃取-異辛烷反萃取-氣相色譜法測定茶葉中6種擬除蟲菊酯農(nóng)藥

1濁點萃取-反萃取茶葉中擬除蟲菊酯農(nóng)藥殘留的檢測方法主要包括相色譜法（rc）和液相色譜法（hplc）。茶葉成分復(fù)雜,在檢測前需要進(jìn)行有效的前處理。其前處理方法主要有固相萃取法(SPE)、固相微萃取法(SPME)、超聲波提取法、微波輔助萃取法(MAE)和基質(zhì)固相分散法(MSPD)等。這些方法耗時繁瑣。濁點萃取(cloudpointextraction,CPE)在某些方面可以代替上述萃取方法。濁點萃取常用于液相色譜分析前有機(jī)樣品的前處理,其優(yōu)點是基本不使用非水溶劑,操作方便,但是在分析過程中常需要解決膠束富集相的粘性、表面活性劑在固定相上吸附、表面活性劑本身在紫外區(qū)的背景干擾及表面活性劑易堵塞氣相色譜柱等問題,所以濁點萃取方法不能與氣相色譜直接聯(lián)用。為了解決此問題,Sikalos等用反萃取方法從濁點萃取的富集相中反萃取6種多聯(lián)芳烴(PAHs);Jia等也用同樣方法從人尿中反萃取有機(jī)磷農(nóng)藥;Zygoura等用濁點萃取-反萃取方法富集了增塑劑。由此可見,由于采用了反萃取方法,進(jìn)一步濃縮了樣品,被分析物質(zhì)的檢出限大為降低。本實驗采用濁點萃取方法萃取了茶葉樣品中6種擬除蟲菊酯農(nóng)藥,然后用異辛烷反萃取,使原富集相體積從0.5mL減少到0.2mL。再用高靈敏的電子捕獲器檢測,與濁點萃取后用液相色譜直接檢測相比,甲氰菊酯、溴氰菊酯、功夫菊酯、氰戊菊酯、氯菊酯和聯(lián)苯菊酯的檢出限分別從2.7,10.2,2.3,7.7,9.8,2.5μg/kg下降到0.4,3.0,0.4,2.1,3.0,0.4μg/kg。2實驗部分2.1hh-s16s聚乙二醇6820氣相色譜儀(美國Agilent公司),配有ECD檢測器;色譜工作站-SrAdV色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(上海軍銳信息技術(shù)開發(fā)有限公司);KQ3200E超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司);AnkeTDL-60B離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠制造);HH-S26S數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇通州試驗儀器廠)。甲氰菊酯(92.4%)、溴氰菊酯(98.8%)、功夫菊酯(95.0%)、氰戊菊酯(96.5%)、氯菊酯(94.0%)和聯(lián)苯菊酯(90.0%)均由江蘇省農(nóng)藥研究所提供。分別稱取6種農(nóng)藥各0.1g,用乙腈溶解,配制成1000mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液Ⅰ,用于濁點萃取過程條件研究;同樣稱取6種農(nóng)藥各0.1g,用異辛烷溶解,配制成1000mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲備液Ⅱ,用于氣相色譜定量分析。上述儲備液在冰箱中保存(4℃),根據(jù)實驗需要稀釋至不同濃度。聚乙二醇6000(PEG6000),配制成20%(m/V)的水溶液;(NH4)2SO4為分析純;乙腈和異辛烷均為色譜純,8%(V/V)乙腈水溶液,實驗用水均為二次重蒸水。2.2富集相的制備用8%(V/V)乙腈水溶液將標(biāo)準(zhǔn)儲備液Ⅰ稀釋到0.01mg/L后,取10mL于20mL刻度試管中,加入0.9mL20%(m/V)PEG-6000和6.0g(NH4)2SO4,待(NH4)2SO4完全溶解后再用8%(V/V)乙腈水溶液定容至15mL,置于30℃水浴中保持30min,最后以3500r/min轉(zhuǎn)速離心10min。用長細(xì)針頭的注射器吸出水相后,剩余的富集相體積<0.5mL,用蒸餾水稀釋至0.5mL后,加入0.2mL異辛烷,超聲25min,取上層異辛烷相1μL進(jìn)氣相色譜檢測。在濁點萃取-反萃取過程中,溶液相當(dāng)于富集了75倍。2.3peg4000、乙腈和nh42so4的制備稱取1.0g已粉碎的市售茶葉樣品于20mL刻度試管中,加入1.5g(NH4)2SO4和5.0mL8%(V/V)乙腈水溶液,充分振蕩搖勻后置于超聲波清洗儀中,超聲60min,過濾后,用6.0mL8%(V/V)乙腈水溶液分3次沖洗殘渣并過濾,濾液置于離心管中,依次往離心管中加入0.9mL20%PEG-6000和4.5g(NH4)2SO4,用8%(V/V)乙腈水溶液定容至15mL,使PEG6000、乙腈和(NH4)2SO4的最終濃度分別為1.2%(m/V)、8%(V/V)和40%(m/V)。然后按2.2項步驟處理。2.4設(shè)備工作流程HP-5石英毛細(xì)管柱(30m×0.32mm,0.25μm);高純氮氣(>99.999%)為載氣;進(jìn)樣口溫度280℃;檢測器溫度300℃;柱升溫程序:起始溫度90℃,恒溫1min后以20℃/min升溫至210℃;恒溫1min后再以3℃/min的速率升溫至280℃,恒溫3min后再以10℃/min的速率升溫至310℃;恒溫10min待測樣品組分全部流出;進(jìn)樣方式:分流進(jìn)樣,分流比2∶8;進(jìn)樣量為1μL。3結(jié)果與討論3.1程序升溫條件考察了不同的程序升溫條件下6種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液的分離情況。結(jié)果表明,采用2.4項的程序升溫條件時,6種農(nóng)藥都能較好的分離。按2.3項樣品處理方法分別對不含以上農(nóng)藥的茶葉和添加標(biāo)準(zhǔn)農(nóng)藥(添加濃度0.01mg/L)的茶葉,其色譜圖如圖1。從圖1可見,茶葉基體對這6種農(nóng)藥色譜分析無影響。3.2濁點萃取條件的選擇3.2.1萃取劑為復(fù)合劑研究了表面活性劑Tween-20、TX-100和PEG6000為萃取劑時6種農(nóng)藥的回收率。結(jié)果發(fā)現(xiàn),Tween-20和TX-100為萃取劑時,平衡溫度均需達(dá)50℃以上,回收率較低;PEG6000為萃取劑時,平衡溫度較低,萃取效果好,故選用PEG6000為萃取劑。以PEG6000為濁點萃取的表面活性劑,當(dāng)其濃度為0.2%~1.2%(m/V)時,各農(nóng)藥的回收率增大;當(dāng)其濃度再增大,對回收率基本沒有影響(圖2),但增大了表面活性劑富集相的體積會降低富集倍數(shù)。本實驗PEG6000的濃度選擇為1.2%(m/V)。3.2.2萃取回收率的測定電解質(zhì)的加入可加快相分離行為,并且降低濁點,(NH4)2SO4易溶解,而且它的加入使聚乙二醇6000體系在室溫下即能夠完成相分離。(NH4)2SO4濃度增加,萃取回收率增大,當(dāng)(NH4)2SO4濃度達(dá)到40%(m/V)時回收率最好,此時溶液接近飽和,再增加(NH4)2SO4的濃度對回收率無影響(圖3)。故實驗中所用(NH4)2SO4的濃度為40%(m/V)。3.2.3平衡30min的回收率實驗探討了不同平衡時間對濁點萃取的影響,濁點萃取體系在30℃水浴中分別保持10~70min。實驗表明,當(dāng)平衡時間為30min時,各個農(nóng)藥的回收率達(dá)到最大;但當(dāng)平衡時間過長,會導(dǎo)致濁點萃取向相反方向變化,表面活性劑相逐漸消失。在兩相完全分離的情況下,平衡30min即可。為使富集相和稀釋相分層清晰,兩相分離后以3500r/min離心10min。3.2.4回收率的測定溫度對于表面活性劑膠束的性質(zhì),尤其是分相后形成的凝聚相體積和含水量均有較大的影響。樣品按照前面優(yōu)化條件處理后,在20,30,40,50和60℃水浴中分別平衡30min。實驗表明(圖4);從20~30℃所有農(nóng)藥回收率上升;30~40℃聯(lián)苯菊酯、氯菊酯和甲氰菊酯回收率基本不變;但溫度高于40℃后回收率下降。而功夫菊酯、溴氰菊酯和氰戊菊酯在30℃后回收率下降。故本實驗采用的濁點萃取溫度為30℃。3.3超聲反萃取法按3.2條件分成清晰兩相的體系,用長注射針從下層移去稀釋相后加入水不互溶溶劑進(jìn)行反萃取。正己烷和氯仿也可以用于反萃取,但是正己烷和氯仿具有強(qiáng)的揮發(fā)性,超聲反萃取過程易揮發(fā)導(dǎo)致結(jié)果重現(xiàn)性差。故選擇異辛烷作為反萃取劑。3.3.1異辛烷體積和用量考察了異辛烷的體積對回收率的影響,異辛烷體積為0.1~0.15mL時,雖然被測組分富集倍數(shù)高,但體積小表面活性劑濃度大,并給轉(zhuǎn)移異辛烷離心凈化帶來不便,檢測重現(xiàn)性差;異辛烷體積過大,被測組分富集倍數(shù)越小;當(dāng)異辛烷體積為0.2~0.3mL時,即可獲得滿意結(jié)果。故選擇0.2mL異辛烷進(jìn)行反萃取。3.3.2異辛烷超聲超聲能加快被測組分從表面活性劑相中轉(zhuǎn)移到異辛烷中,為防止異辛烷揮發(fā),在封閉狀態(tài)下進(jìn)行超聲。圖5顯示反萃取效率隨超聲時間增加而增加。當(dāng)超聲25min時,異辛烷的萃取效率最高。3.3.3上層異辛烷相對清液的制備經(jīng)超聲分離后的異辛烷-表面活性劑富集相界面不清晰,為凈化異辛烷相,將上層異辛烷小心移到1.5mL離心管中,以6000r/min離心3min后,取上層清液進(jìn)樣。3.4進(jìn)樣的檢測限和定量限取不同濃度的6種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液按照2.4項的色譜條件分別進(jìn)樣,確定它們的定量范圍和檢出限。為了與高效液相色譜法比較,將按步驟2.2取得的表面活性劑富集相直接注入HPLC系統(tǒng),得到的檢出限列入表1。從表1可見,反萃取法檢出限比HPLC方法下降了2.3~5.8倍。3.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定在1.00g空白茶樣里分別添加3種不同濃度(0.01,0.05和0.1mg/kg)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液各1.0mL,充分混勻后測定5次,結(jié)果見表2。3.6新鮮茶葉的采集將濃度約50μg/kg的6種農(nóng)藥的混合溶液噴灑在未噴灑過農(nóng)藥的新鮮茶葉上,2h后采集;取風(fēng)干后(剪碎)的新鮮茶葉1.00g于20mL刻度試管中,添加濃度為20μg/kg的6種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0mL,以本方法進(jìn)行檢測,結(jié)果見表3。4農(nóng)藥殘留定量的規(guī)定采用