痛風(fēng)利濕口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

痛風(fēng)利濕口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

風(fēng)濕劑是大黃、山楂、王不留行等中藥制備的復(fù)方制劑。具有外散風(fēng)邪、內(nèi)通經(jīng)絡(luò)、風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、四肢癱瘓、陰疽病和高脂血癥的功效。為控制該藥的內(nèi)在質(zhì)量,確保用藥安全有效,本試驗(yàn)中建立了方中大黃、山楂、王不留行等藥材的薄層色譜定性鑒別,以及大黃素含量的高效液相色譜測定方法,為痛風(fēng)利濕口服液質(zhì)量控制提供依據(jù)。1超聲波清洗器設(shè)備玻璃點(diǎn)樣毛細(xì)管(華西醫(yī)科大學(xué)儀器廠);硅膠G薄層板(煙臺大學(xué)生物科學(xué)與工程研究所);CS-15R型低溫離心機(jī)(美國Beckman公司);電子天平(Sartorius公司);KQ-500E型醫(yī)用超聲波清洗器;高效液相色譜儀(HPLC125/166,美國Beckman公司)。大黃素對照品(批號為0756-9707)、熊果酸對照品(批號為110742-200313)、王不留行對照藥材(批號為1094-200001),均由中國藥品生物制品檢定所提供;其他試劑均為分析純;痛風(fēng)利濕口服液(自制)。2方法和結(jié)果2.1不同種類樣品的鑒別大黃:取本品20mL,加鹽酸1.5mL,回流提取30min,加乙醚萃取3次,每次10mL,分取乙醚液,水洗2次,每次10mL,合并乙醚液,殘?jiān)蛹状?mL使溶解,作為供試品溶液。再取缺大黃樣品,同法制成陰性對照品溶液。另精密稱取大黃素對照品,加甲醇制成每1mL含1mg的溶液,作為對照品溶液。吸取上述溶液各2～5μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以石油醚(30～60℃)-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)的上層溶液為展開劑,展開,取出,晾干,在日光燈下檢視。供試品溶液色譜中,在與對照品溶液色譜相應(yīng)的位置顯相同顏色的斑點(diǎn),而陰性對照品溶液色譜中則無此斑點(diǎn),見圖1A。山楂:取本品20mL,加硅藻土10g,混勻后加乙醚20mL,超聲處理15min,濾過,濾液揮干,殘?jiān)訜o水乙醇1mL使溶解,作為供試品溶液。取缺山楂的陰性樣品,同法制成陰性對照品溶液。精密稱取熊果酸對照品,加無水乙醇制成1mL含1mg的溶液,作為對照品溶液。吸取上述溶液各2～5μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以環(huán)己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯(20∶5∶8)為展開劑,展開,取出,晾干,噴以10%硫酸乙醇溶液,于110℃加熱10min。供試品溶液色譜中,在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn),而陰性對照品溶液色譜中則無此斑點(diǎn)。見圖1B。王不留行:取本品10mL,加甲醇10mL,加熱回流30min,放冷,濾過,濾液蒸干,殘?jiān)蛹状?mL溶解,作為供試品溶液。取缺王不留行的陰性樣品,同法制成陰性對照品溶液。精密稱取王不留行對照藥材2g,磨成粉末,加甲醇20mL,回流30min,放冷,濾過,濾液蒸干,殘?jiān)蛹状?mL使溶解,作為對照品溶液。吸取上述溶液各2～5μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以三氯甲烷-甲醇-水(15∶7∶2)的下層溶液為展開劑,展開,取出,晾干,噴以碘化鉍鉀溶液顯色。供試品溶液色譜中,在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn),而陰性對照品溶液色譜中則無此斑點(diǎn)。見圖1C。2.2重量測定2.2.1流動相、流速色譜柱:DiamonsilC18柱(250mm×4.6mm,5μm);流動相:甲醇-0.1%磷酸(85∶15);流速:1.0mL/min;柱溫:室溫;檢測波長:254nm。2.2.2供試品溶液的制備精密稱取干燥至恒重的大黃素對照品6mg,加無水乙醇-乙酸乙酯(2∶1)使溶解,定容至100mL,作為對照品溶液。精密吸取10mL樣品,加鹽酸1mL,置水浴上加熱回流30min,冷卻后,用三氯甲烷萃取3次,每次10mL,取三氯甲烷層液合并,水洗2次,蒸干,殘?jiān)脽o水乙醇-乙酸乙酯(2∶1)溶解,定容為10mL,低溫離心(13000轉(zhuǎn)/min)5min,取上清液作為供試品溶液。按處方組成,取缺大黃以外的其余藥材,按制備工藝要求制成不含大黃的陰性樣品,再按供試品溶液的制備方法制備陰性對照品溶液。2.2.3穩(wěn)定性及回收試驗(yàn)精密度試驗(yàn):分別精密吸取質(zhì)量濃度為48.0μg/mL的對照品溶液,連續(xù)進(jìn)樣5次。結(jié)果的RSD=0.9%,表明儀器精密度良好。重復(fù)性試驗(yàn):取同一批號的樣品,依法制備供試品溶液并測定。結(jié)果的RSD為3%(n=5),表明方法重復(fù)性較好。穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一供試品溶液20μL,分別于1,2,4,6,8,12h時進(jìn)樣測定。結(jié)果的RSD=3%(n=6),表明供試品溶液中大黃素在12h內(nèi)穩(wěn)定。加樣回收試驗(yàn):精密吸取已知含量的樣品(含量為1.7251μg/mL)3份,每份10mL,分別加入15,30,45μg/mL3種質(zhì)量濃度的大黃素對照品溶液各1mL,按供試品溶液制備方法平行操作3次,定容至10mL。分別精密吸取3個質(zhì)量濃度的溶液1mL,各用甲醇定容至10mL,進(jìn)樣測定,計算回收率。結(jié)果見表1。2.2.4樣品含量的測量按擬訂的方法,測定3批樣品溶液中大黃素制的含量。結(jié)果見表2,痛風(fēng)利濕口服液樣品中大黃素含量不低于1.7μg/mL。3流動相甲醇-0.1%磷酸溶液的制備用薄層色譜法鑒別痛風(fēng)利濕口服液中的大黃時,筆者曾采用超聲方法直接提取大黃素,結(jié)果斑點(diǎn)不明顯,后改作用回流提取,結(jié)果斑點(diǎn)較清晰。對照品溶液紫外光譜掃描測定,結(jié)果供試品溶液在254nm波長處有較強(qiáng)吸收峰,故確定檢測波長為254nm。曾使用甲醇-0.1%磷酸水溶液的比例為80∶20,此流動相時要檢測的大黃素出峰時間靠后,調(diào)整比例為85∶15后,出峰時間在13～14min之間,可節(jié)約有效時間。而再增大甲醇的比例,則大黃素峰與前一個峰分開不明顯,不利于檢測,故流動相甲醇-0.1%磷酸水溶液的最佳比例為85∶15。在供試品液的制備中,開始使用加入甲醇后超聲提取,蒸干后用甲醇溶解,離心后作供試品溶液。此方法雜質(zhì)干擾峰太多,且分離效果不理想,后改作加少量鹽酸回流提取,用三氯甲烷萃取,再用水洗,回收濾液,蒸干后用乙醇-乙酸乙酯(2∶1)溶解,圖譜比較理想,且分離效果顯著,鋒形相對尖銳?？瞻赘蓴_試驗(yàn):取2.2.2項(xiàng)下3種溶液,按擬訂的色譜條件進(jìn)行檢測。結(jié)果供試品溶液色譜中呈現(xiàn)與對照品溶液保留時間相同的色譜峰(見圖2),處方中其他藥材對大黃素的測定無干擾。線性關(guān)系考察:精密吸取對照品溶液2,4,6,