流式細胞術檢測細胞因子的研究進展

流式細胞術檢測細胞因子的研究進展

主要活性物質和環(huán)境反應的主要指南和調節(jié)。正常情況下,細胞因子的表達和分泌受到嚴格的調控,病理狀態(tài)下會出現(xiàn)異常表達,故檢測細胞因子對于疾病的診斷、治療具有重要意義。細胞因子免疫學檢測方法基本原理是將細胞因子作為抗原,用針對該抗原的特異性抗體進行定量或定性的檢測。既往檢測技術主要采用ELISA法,由于細胞因子半衰期不同,其檢測結果的準確性降低。酶聯(lián)免疫斑點技術(enzyme-linkedimmunospotassay,ELISPOT)檢測的是分泌細胞因子的細胞數(shù)量,不受細胞因子代謝的影響,能比較真實反應體內細胞因子水平,已得到廣泛研究并應用到臨床結核感染的診斷中。流式細胞術(flowcytometry,FCM)能明確產(chǎn)生細胞因子的細胞數(shù)量,不僅可同時檢測幾種細胞因子,還可確定產(chǎn)生細胞因子的細胞亞型,是一種相對快速并能準確定量的檢測細胞因子的方法。一、fcm檢測細胞因子的方法FCM是20世紀70年代發(fā)展起來的一種對液流中排成單列的細胞或其他生物微粒逐個進行快速定量分析和分選的技術,可測定細胞大小、DNA/RNA含量、細胞表面抗原表達等多種參數(shù),也可分類收集特定的細胞或細胞器,臨床上廣泛應用于感染性疾病、血液系統(tǒng)疾病、腫瘤學等多個學科。FCM檢測ICK的方法是運用熒光標記的抗細胞表面抗原單抗和抗細胞因子單抗,檢測單個細胞內多個細胞因子,可區(qū)分表達特定細胞因子的細胞亞群,不僅能了解細胞因子的量和產(chǎn)生細胞因子的細胞類型,還能了解細胞內細胞因子產(chǎn)生的動力學。FCM檢測ICK技術主要是通過細胞因子特異的單克隆抗體進行細胞內免疫熒光染色,并結合膜表面抗原染色,用多色FCM分析各種細胞內合成的細胞因子,并對免疫細胞進行分類,如輔助性T細胞(Th1、Th2)等,為疾病的早期診斷和治療提供重要依據(jù)。方法是通過體外多克隆激活劑激活細胞,同時以阻斷劑阻斷胞內高爾基體介導的蛋白質轉運,抑制細胞因子釋放到細胞外,使產(chǎn)生的細胞因子在細胞質內蓄積,使其信號增強。經(jīng)細胞膜固定和破膜劑增加細胞的通透性后,用抗細胞因子的抗體與細胞內特定的分子相結合,通過非相關特異性同型匹配的抗體作為對照,確定靜止的與無細胞因子分泌的細胞的最小熒光背景,既可用FCM檢測不同的細胞亞群分泌的ICK。二、在其他領域的研究和應用FCM技術在腫瘤疫苗、HIV感染、自身免疫病等領域已得到較為廣泛的研究和應用。近年來,FCK檢測ICK技術在結核感染的診斷及治療療效評價等方面也進行了較為深入的研究并取得一定進展。1.mdna的耐藥基因檢測結核菌素試驗是檢測結核分枝桿菌感染的傳統(tǒng)檢測手段,但其與卡介菌和環(huán)境分枝桿菌存在交叉反應,其特異性較差。由于IFN-γ是細胞免疫介導的最為關鍵的細胞因子,因此應用結核特異性抗原檢測特異性T淋巴細胞合成或分泌IFN-γ的濃度或效應T淋巴細胞的數(shù)量可以判斷機體是否感染結核分枝桿菌。Cosmi等應用FCM細胞內細胞因子染色技術對活動性結核、隱性結核感染、卡介苗接種者和健康志愿者的全血標本,應用結核菌素純蛋白衍生物(PPD)和早期分泌抗原靶蛋白-6(ESAT-6)作為抗原,檢測CD4+T細胞的表達,結果提示,活動性結核、結核潛伏感染患者的PPD特異性T淋巴細胞比例較BCG接種的志愿者明顯升高?？乖嘤?活動性結核、結核潛伏感染患者較未接種卡介苗及接種卡介苗的健康志愿者CD4+CD69+IFN-γT細胞明顯升高,而在未接種卡介苗與接種卡介苗的健康志愿者中ESAT-6特異性淋巴細胞未見明顯區(qū)別。提示應用流式技術,ESAT-6作為抗原可鑒別出結核潛伏感染與健康志愿者和BCG接種者。同時,還可鑒別出TST陰性的結核和非結核分枝桿菌感染。提示流式胞內細胞因子檢測技術較TST在診斷結核感染方面有更高的陽性預測值。研究證實,采用多色免疫熒光和胞內細胞因子的染色技術,以ESAT-6作為抗原,檢測抗原特異性CD4+T淋巴細胞,均得到較高的陽性率,提示此方法可作為結核感染的一種診斷手段。2.細胞因子檢測在細胞因子的多項檢測研究中,應用不同的抗原及不同的培養(yǎng)時間,有時會得到迥異的結果。Antas等應用流式細胞術對結核患者細胞因子產(chǎn)生的動力學進行了研究,以PPD作為抗原,測定結核患者外周血單個核細胞(peripheralbloodmononuclearcells,PBMC)抗原特異性T淋巴細胞的表達并對不同時間段(8、12、16、20及24h)細胞因子的產(chǎn)生進行了動態(tài)觀察,結果顯示,IFN-γ產(chǎn)生的峰值時間為16h,IL-4產(chǎn)生的峰值時間為24h。培養(yǎng)后用流式方法很快就可檢測出細胞因子,而上清中細胞因子濃度需在培養(yǎng)后24h方可檢出。因為培養(yǎng)上清中的細胞因子的水平代表的是分泌的細胞因子數(shù)量,它受細胞因子合成、轉運、在高爾基體的聚集及分泌幾種參數(shù)的影響,而胞內細胞因子的檢測只受細胞因子合成的影響,因此,FCM檢測ICK技術是一種更可靠且重復性好的檢測細胞因子的方法。3.抗結核治療后細胞中ifn-的表達為了明確結核患者治療前后細胞因子的動態(tài)變化,Veenstra等對結核患者外周全血經(jīng)抗CD3單克隆抗體刺激后進行檢測,CD4+、CD8+T淋巴細胞產(chǎn)生IFN-γ的細胞比例最高達13%,較非結核患者有明顯升高,而抗結核治療1周后,產(chǎn)生IFN-γ的細胞比例有所下降,治療26周時,IFN-γ產(chǎn)生細胞的比例降至正常水平。結果顯示,抗結核治療后隨著結核病變的好轉,體內的結核分枝桿菌減少,抗原刺激減弱,抗原特異性T淋巴細胞隨之減少。因此,考慮FCM檢測治療前后細胞因子的動態(tài)變化可對患者的治療療效有提示作用。4.結核性胸液的免疫檢測胸腔積液中的單個核細胞(pleuraleffusionmononuclearcells,PEMC)數(shù)量顯著高于PBMC數(shù)量,甚至可以達到PBMC的15倍,故理論上認為對感染局部進行抗原特異性T淋巴細胞的檢測有可能獲得更高的敏感性,因此,結核性胸液的各項免疫學指標較全血更有意義。Lee等應用流式技術檢測抗原特異性細胞因子診斷結核性胸腔積液的敏感性為91%。杜鳳嬌等應用流式細胞術檢測結核性胸水中PEMC經(jīng)ESAT-6/CFP-10融合蛋白刺激后抗原特異性TH1百分比診斷結核性胸水的敏感性為87.5%,特異度為90.0%。與同時進行的ELISPOT技術檢測的診斷敏感性和特異性水平相當。因此,應用流式技術檢測抗原特異性細胞因子可用于結核性胸膜炎的診斷中,尤其對相關檢查結果不特異的患者可提供重要幫助。5.細胞因子的檢測李麗等對結核性胸腔積液PEMC檢測ESAT-6抗原刺激后,依據(jù)CD4+T細胞分泌TH1型細胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-2的不同組合,其中TNF-α單陽性細胞的比例最高,其次為Th1細胞(IFN-γ+TNF-α+IL-2+),即胸液中存在相當比例的Th1細胞,其不僅分泌細胞因子種類最多,且分泌細胞因子的量也明顯高于其他亞群,因此很可能在局部結核控制中發(fā)揮重要的保護效應。Qiao等應用EAST-6和CFP-10作為抗原,檢測刺激結核性胸液中PEMCIFN-γ、IL-17和IL-22,結果顯示,IFN-γ、IL-17均得到高表達,以IFN-γ高表達占明顯優(yōu)勢。因流式方法可同時檢測幾種細胞因子,因此,在對細胞因子功能檢測方面有重要作用。胥萍等研究發(fā)現(xiàn),初治肺結核患者外周血中CD4+IFN-γ+水平均顯著低于健康對照組,CD4+IL-4+水平則顯著高于健康對照組。粟粒性肺結核患者外周血中Thl細胞含量顯著低于繼發(fā)性肺結核患者,Th2水平顯著高于繼發(fā)性性肺結核和結核性胸膜炎。CD4+/CD3+T比例在3種結核病程中均呈下降趨勢,且粟粒性肺結核顯著低于繼發(fā)性肺結核。提示不同類型結核病患者均存在不同程度的免疫功能減低,對Th1、Th2水平與CD4+/CD3+測定可助于臨床病情的判斷和療效觀察。6.cd27通過了pd-pcr和cfp-10在耐藥理關于結核感染的診斷目前已有較為公認的診斷指標,如T-SPOT-TB方法,但活動性結核病與結核感染目前尚無明確的鑒別診斷指標。研究顯示,活動性結核患者IFN-γ+CD4+T細胞多為CD27-細胞,提示在活動性結核病中,CD27-細胞可能為活動性結核病的診斷提供幫助。一項大鼠肺結核模型的實驗對此也做了進一步驗證,提示CD27可能為活動性結核和結核感染或非結核患者的鑒別提供幫助。Sargentini等以PPD和ESAT-6/CFP-10作為抗原,應用流式技術檢測活動性結核病、結核潛伏感染和健康志愿者PBMC抗原刺激后細胞因子IFN-γ、IL-2、IL-10、IL-17,結果顯示,潛伏結核感染患者的IL-2分泌較活動性結核患者升高有統(tǒng)計學意