當歸提取物對貧血小鼠的抗血藥譜效相關性研究

當歸提取物對貧血小鼠的抗血藥譜效相關性研究

當歸是一門不同于傘科umbrelia的植物的當歸（oliv.）。它具有活血、活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤腸排便的功效。用于血虛萎黃,眩暈心悸,月經(jīng)不調(diào),經(jīng)閉痛經(jīng),虛寒腹痛,腸燥便秘,風濕痹痛,跌仆損傷,癰疽瘡瘍?！毒霸廊珪静菡吩?當歸,其味甘而重,故專能補血、活血;其氣輕而辛,故又能行血。補中有動,行中有補,誠血中之氣藥,亦血中之圣藥也。對當歸的藥理作用和化學成份的現(xiàn)代研究表明,當歸對機體的心血管系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等均具有顯著的藥理作用,當歸及其有效成分揮發(fā)油類、香豆素類、有機酸類、糖類、黃酮類、氨基酸、維生素和其他微量元素對機體血液、免疫、神經(jīng)、循環(huán)、呼吸等系統(tǒng)均有較強的藥理作用,其中有機酸類中主要成分阿魏酸,能有效抑制血小板聚集和血栓形成,當歸內(nèi)酯能促進胸腺、脾細胞的增殖。當歸中其他眾多的化學成份和化學成分群與活血補血作用的關系未見文獻報道。本文采用化學藥物損傷法造成小鼠血虛模型,首先研究比較了當歸不同提取部位對血虛模型小鼠的外周血象和免疫器官的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)水提醇沉上清部位補血、活血作用較為明顯;因此用高效液相色譜法研究了該部分的指紋圖譜,觀察了不同批次當歸藥材水提醇沉上清部位補血、活血作用,用灰關聯(lián)度法分析了該部位指紋圖譜與補血、活血作用的譜效關聯(lián),從中找到了20個與補血活血作用關聯(lián)度大的成分,建立了基于活血補血作用的當歸指紋圖譜,為臨床使用當歸治療血虛證提供了理論依據(jù)。1材料表面1.1阿魏酸、本內(nèi)酯、洋基肥兩藥物的鑒定當歸藥材(10批,蘭州佛慈制藥股份有限公司提供,主產(chǎn)于甘肅定西和隴南,以及云南鶴慶),經(jīng)柴國林高級工程師(蘭州佛慈制藥股份有限公司)鑒定為Angelicasinensis(Oliv.)Diels。阿魏酸(中國食品藥品檢定研究所,HPLC≥98%,批號100834-200701),藁本內(nèi)酯(中國食品藥品檢定研究所,HPLC≥98%,批號110756-200110),洋川芎內(nèi)酯H(上海一林生物科技有限公司,HPLC≥98%,批號YL2013020301),洋川芎內(nèi)酯I(上海一林生物科技有限公司,HPLC≥98%,批號YL2013021501)。色譜甲醇(山東禹王試劑公司),純凈水(蘭州大學第一醫(yī)院生產(chǎn)),醋酸(北京華盾化工公司),95%乙醇(北京金輝化學試劑有限公司),乙酰苯肼(APH,上海勁馬生物科技有限公司),聚山梨酯-80(吐溫-80,江蘇省海安石油化工廠。)1.2中藥色譜指紋圖譜Watersalliance2695高效液相色譜儀,Waters2996型PDA檢測器,Millenium32色譜工作站;1.0中藥色譜指紋圖譜計算機輔助相似性評價系統(tǒng)軟件(中南大學);超聲儀:KQ-400DB;sartoriusBP211D1/10天平;sartoriusBS224S1/1萬天平;SF-3000血細胞分析儀(日本SYSMEX公司)。1.3動物昆明種小鼠,18~22g,雌雄兼用,由蘭州大學動物實驗中心提供,合格證號SCXK(甘)2009-0004。2方法和結(jié)果2.1提取部位的提取取當歸藥材100g,加7倍量水,按2010年版《中國藥典》方法,連續(xù)蒸餾8h,收集油層。油層用乙醚萃取3次,合并萃取液,除去乙醚即得部位1,即為揮發(fā)油(提取率為0.4%)。水提取液過濾后濃縮至濃度為1g·mL-1。加95%乙醇至乙醇濃度為80%沉淀,靜置24h。過濾后得沉淀和上清液,沉淀加水溶解后濃縮至浸膏得部位2,即為當歸粗多糖(提取率為30%);上清液濃縮得部位3,即為水提醇沉上清部位(提取率約為24%)。另取當歸藥材100g,加入10,8,6倍量70%乙醇分別提取60,45,45min,提取液離心后合并,濃縮得部位4,即為70%乙醇提取部位(提取率為60%)。10批當歸藥材用同法處理。其中揮發(fā)油加0.3%吐溫-80制成混懸液,其他各組提取物加水溶解,質(zhì)量濃度為0.24g·mL-1(按生藥量計算)。2.2給藥后小鼠的急性毒性檢測60只小鼠,雌雄各半,隨機分為空白組、模型組、部位1組、部位2組、部位3組、部位4組,每組10只。除空白組外,其余各組分別于實驗第1,4,7d皮下注射APH,劑量為200,100,100mg·kg-1(0.01mL·g-1體重),于造模第10d開始灌胃給予當歸提取物(生藥劑量為2.4g·kg-1體重,0.01mL·g-1體重),空白組和模型組給予等量生理鹽水,1次/d,連續(xù)10d。末次給藥后30min,尾靜脈取血20μL,檢測其紅細胞(RBC)、血紅蛋白(Hb)和血小板(PLT)數(shù)量。用脊椎脫臼法將小鼠全部處死,取其胸腺和脾臟,稱重,根據(jù)公式計算胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。結(jié)果見表1,2。胸腺或脾臟指數(shù)=胸腺或脾臟濕重/體重×100模型組小鼠在給藥后,紅細胞、血紅蛋白、血小板計數(shù)和胸腺指數(shù)均較空白對照組低,脾指數(shù)較空白對照組高,均具有統(tǒng)計學差異(P<0.05),說明小鼠血虛模型成功復制。與模型組比較,各給藥組的紅細胞、血紅蛋白、血小板計數(shù)和胸腺指數(shù)有不同程度的升高,脾指數(shù)有所下降,說明當歸各部分提取物對APH致血虛癥狀有一定的改善。其中部位3組作用最明顯,與模型組比較,部位3組紅細胞計數(shù)、血紅蛋白計數(shù)、血小板計數(shù)、胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均有顯著性差異(P<0.05)。因此,對10批當歸藥材部位3,即DSC部分進行藥效與指紋圖譜的灰關聯(lián)度分析。2.31給藥方式及樣品處理情況取小鼠120只,雌雄各半,隨機分為空白組、模型組、10批DSC組,每組10只。各組給藥方式、樣品處理過程同2.2項。結(jié)果見表3,4。由表3,4可見各給藥組對APH致血虛癥狀均有一定的改善作用。其中4,6和10號樣效果更好,說明文縣、宕昌縣和岷縣DSC部位對APH致血虛癥狀有更好的改善作用。2.4不同產(chǎn)地的當歸醇沉積層hplc指紋圖2.4.1動相、洗脫、流動線溫度DiamonsilODS-C18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm);流動相:甲醇(A)-1%醋酸溶液(B),梯度洗脫(0~25min,5%~25%A;25~50min,25%~60%A;50~65min,60%~80%A);流速1.0mL·min-1;柱溫30℃;檢測波長280nm;進樣量20μL。2.4.2標準曲線測定任務用液取當歸水提醇沉上清部位浸膏0.5g,精密稱定,置于10mL量瓶,加甲醇溶解,定容至刻度。搖勻,即得供試品溶液,過0.45μm微孔濾膜,備用。2.4.3對照品溶液的制備分別精密稱取阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯H和藁本內(nèi)酯對照品適量,用甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.212,0.380,0.326,0.788g·L-1的對照品溶液。2.4.4色譜指紋圖譜分別精密吸取供試品溶液和對照品溶液20μL,進樣,按2.4.1項下色譜條件測定。記錄65min色譜圖。色譜指紋圖譜中有20個峰是各供試品所共有的,因此確定這20個峰為共有峰。其中10,14,15,20號峰與對照品阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯H和藁本內(nèi)酯的保留時間和紫外光譜圖一致,確定其為阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯H和藁本內(nèi)酯。見圖1,2。2.5水提醇沉上清部位的血脂、溶血作用10批當歸藥材DSC部位共有峰峰面積及補血、活血藥效值(R)見表5。將原始數(shù)據(jù)進行標準化轉(zhuǎn)換后,計算關聯(lián)系數(shù)和關聯(lián)度。研究結(jié)果表明,指紋圖譜中各峰所代表的化學成分與補血、活血作用有一定的關聯(lián)(P>0.65),表明當歸水提醇沉上清部位的補血、活血作用是其所有化學成分共同作用的結(jié)果。其中1,2,5,6,8,10,15,17,18和19號峰所代表的化學成與補血、活血作用有較高的關聯(lián)度(P>0.8)。各特征峰代表不同的化學成分。根據(jù)關聯(lián)度的大小,確定各成分對補血、活血貢獻的大小順序為:10>2>1>5>18>19>6>8>15>17>14>3>9>11>16>13>20>7>12>4。其中,10,14,15和20號峰分別為阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯H和藁本內(nèi)酯。3歸正經(jīng)理鑒定樣品,主要分乙酰苯肼(APH)是強氧化劑,對紅細胞有緩慢的進行性氧化性損傷作用,從而造成機體溶血性貧血。本實驗用APH制備小鼠血虛模型,結(jié)果模型組小鼠的日?；顒?、進食和皮毛色澤,以及血象、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)均與空白組有顯著性差異,表明小鼠血虛模型復制成功,給藥后小鼠各項指標均有改善,表明當歸水提醇沉上清部位具有改善小鼠血虛癥狀的作用。采用灰關聯(lián)度分析當歸水提醇沉上清部位譜效關系,結(jié)果表明指紋圖譜中各個峰所代表的化學成分與補血、活血作用的關聯(lián)度均大于0.65,說明當歸水提醇沉上清部分的補血、活血作用是其內(nèi)“化學成分群”共同作用的結(jié)果。本研究根據(jù)關聯(lián)度大小來確定DSC部分對補血、活血作用貢獻的大小,明確了提取物中HPLC圖譜共有峰的成分特征及與補血、活血藥效的相關性,初步確認了當歸的有效部位的藥效物質(zhì)基礎。但是,由于當歸中化學成分復雜且相對不穩(wěn)定,目前只確定了其中的阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯H及藁本內(nèi)酯,其他化學成分有待進一步研究。10批當歸藥材的DSC部分對APH致血虛癥狀