三角帆蚌肝臟瘟病感染期抑制性消減cdna文庫(kù)的構(gòu)建

三角帆蚌肝臟瘟病感染期抑制性消減cdna文庫(kù)的構(gòu)建

三角帆蚌是屬于軟體動(dòng)物門的側(cè)面門的真水面。屬于子牙科和蚌科。它是中國(guó)特有的純淡水養(yǎng)殖貝類，占淡水養(yǎng)殖珍珠蚌的95%以上。近年來(lái),由于三角帆蚌瘟病的頻發(fā)給淡水珍珠產(chǎn)業(yè)造成了巨大損失,嚴(yán)重阻礙了珍珠產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。20世紀(jì)80年代以來(lái),針對(duì)三角帆蚌瘟病的病原、組織病理以及防治方法等方面開展了一系列的研究,但是三角帆蚌瘟病仍舊沒(méi)有得到有效防治,而且關(guān)于三角帆蚌瘟病原有病毒和細(xì)菌兩種說(shuō)法。邵健忠等對(duì)三角帆蚌瘟病病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),肝臟、胃、腸道和直腸是病原侵害的主要的器官。本課題組研究表明,病毒為三角帆蚌瘟病的原發(fā)性病原,細(xì)菌是繼發(fā)性病原;肝臟是該病最先發(fā)病的器官,也是受損壞最嚴(yán)重的器官。肝臟作為三角帆蚌的主要免疫器官,在機(jī)體解毒、對(duì)外來(lái)微生物吞噬過(guò)程中均具有重要意義。但至今有關(guān)三角帆蚌肝臟在抵抗瘟病病毒侵害過(guò)程中作用的研究還十分有限,肝臟免疫系統(tǒng)、免疫機(jī)制和免疫相關(guān)基因的報(bào)道也較少。本研究利用抑制消減雜交技術(shù)(suppressionsubtractivehybridization,SSH)構(gòu)建了瘟病病毒感染后三角帆蚌肝臟差異表達(dá)cDNA消減文庫(kù),并對(duì)獲得的序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,結(jié)果為探討三角帆蚌免疫機(jī)制以及抗病新品種的培育提供基礎(chǔ)。1材料和方法1.1接種三角蝶豬監(jiān)察病病毒的發(fā)病情況取健康三角帆蚌(購(gòu)自常德)置水族箱中暫養(yǎng)7d,按文獻(xiàn)方法制備接種三角帆蚌瘟病病毒,28℃飼養(yǎng),觀察發(fā)病情況。8d開始有蚌病死現(xiàn)象,至2周左右達(dá)到高峰。取2周未死個(gè)體的肝臟組織,滅菌DEPC水清洗,迅速分裝放入液氮中凍存?zhèn)溆谩?.2角船肝臟正向cdna消減為總體性毒力體檢測(cè)利用TRIzol(Invitrogen)分離三角帆蚌誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)肝臟組織總RNA;使用OligotexTM-dT30<super>mRNAPurificationKit(TaKaRa),分離mRNA。紫外分光光度測(cè)定RNA濃度,甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳分析觀察結(jié)果。抑制性消減雜交采用PCR-SelectTMcDNASubtractionKit(Clontech)。以瘟病病毒感染組的肝臟作為消減雜交的實(shí)驗(yàn)方(Testers),正常組的肝臟作為驅(qū)動(dòng)方(Driver)。DrivercDNA的制備是將正常組肝臟組織mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA,然后用RsaⅠ充分酶切3h后完成。TestercDNA的制備是將感染后未死組肝臟組織合成的雙鏈cDNA用RsaⅠ酶切后,分成2份,分別與adaptor1和adaptor2R連接后即制成Tester-1cDNA和Tester-2cDNA。以制備好的肝臟DrivercDNA和TestercDNA分別進(jìn)行抑制性消減雜交。抑制消減雜交過(guò)程:首先將Tester-1cDNA和Tested-2cDNA分別與DrivercDNA進(jìn)行第1次雜交,混合2種雜交產(chǎn)物,再與新變性的DrivercDNA進(jìn)行第2次雜交,雜交產(chǎn)物隨后以引物primer1(試劑盒提供)進(jìn)行第1次PCR擴(kuò)增,第1次PCR產(chǎn)物再用引物Nestedprimer1和2R(試劑盒提供)進(jìn)行第2次PCR擴(kuò)增,使特異于正常組肝臟組織差異表達(dá)的基因得到指數(shù)擴(kuò)增。用鮑β-actin特異的上游引物:5′-CACTGTGCCCATCTACGAG-3′,下游引物:5′-CCATCTCCTGCTCGAAGTC-3′,對(duì)消減后第2次PCR產(chǎn)物進(jìn)行消減效率檢測(cè)。同時(shí),以未經(jīng)抑制性消減雜交的cDNA(在制備TestercDNA連接2種接頭時(shí),將剛加好樣還未進(jìn)行連接反應(yīng)的Tester-1cDNA和Tester-2cDNA各取2μL混合,進(jìn)行連接反應(yīng)完成)作為對(duì)照進(jìn)行PCR。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5min,然后94℃,30s;60℃,30s;72℃,2min,擴(kuò)增33個(gè)循環(huán),分別在第18,23,28,33循環(huán)處取5μL進(jìn)行電泳,以檢測(cè)消減效率。將第2次PCR的產(chǎn)物連接到載體pUCm-T(Promega公司),轉(zhuǎn)化到JM109感受態(tài)細(xì)胞,將菌液均勻凃布于含Amp的LB/X-gal/IPTG培養(yǎng)基上,在生化培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)16h,構(gòu)建三角帆蚌肝臟正向cDNA消減文庫(kù)。隨機(jī)挑取白色菌落接種于1mLLB液體培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)過(guò)夜。用接頭內(nèi)側(cè)序列引物[M13+:5′d(GTAAAACGACGGCCAGT)3′,M13-:5′d(AACAGCTATGACCATG)3′]進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5min,然后94℃,30s;54℃,30s;72℃,1min,擴(kuò)增25個(gè)循環(huán),取5μL反應(yīng)液進(jìn)行電泳,確定是否有片段插入以及插入片段大小和分布范圍。隨機(jī)挑選載有插入差異表達(dá)片段的陽(yáng)性克隆300個(gè)測(cè)序,測(cè)序結(jié)果采用DNAMAN序列分析軟件對(duì)原始序列進(jìn)行修正與分析,利用BlastN、BlastX分別進(jìn)行比對(duì)分析。2結(jié)果與分析2.1rna的完整性紫外分光光度檢測(cè)總RNAOD260/OD280分別為1.89和1.93,電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在28S,18S位置有2條完整、明顯的帶(圖1),表明RNA純度較高,完整性好,符合建庫(kù)要求。2.2接口連接效率以RsaⅠ核酸內(nèi)切酶將等量的來(lái)自誘導(dǎo)后未死三角帆蚌肝臟組織及正常三角帆蚌肝臟組織的cDNA消化成長(zhǎng)度約為0.1～2.0kb的片段,以利于后續(xù)的adaptorl,adaptor2R與其連接并進(jìn)行后續(xù)的雜交,連接效率是SSH文庫(kù)構(gòu)建成敗的重要因素。圖2顯示了檢測(cè)Tester-1cDNA和Tester-2cDNA的接頭連接效率的結(jié)果。2,4泳道用β-actin的上游和下游引物做PCR,1,3泳道用adaptorl和adaptor2R共有序列的引物PCRprimerl以及β-actin的下游引物進(jìn)行擴(kuò)增。如果連接成功,則1,3泳道的PCR產(chǎn)物將大于2,4泳道。由圖2可見(jiàn),1,3泳道產(chǎn)物明顯大于2,4泳道,結(jié)果表明,dscDNA與接頭的連接是成功的。2.3組非成三角蝶壓力的生物酶pcr擴(kuò)增將制備的DrivercDNA和TestercDNA分別進(jìn)行2輪雜交和2輪PCR即完成三角帆蚌肝臟組織消減cDNA文庫(kù)的構(gòu)建。從文庫(kù)2次PCR擴(kuò)增可以看出,2輪PCR擴(kuò)增后的雜交產(chǎn)物為一彌散的cDNA群體,雜交產(chǎn)物主要集中在200～1000bp之間,而且內(nèi)含有幾條較為清晰的條帶(圖3)。結(jié)果初步顯示,已經(jīng)成功構(gòu)建了肝臟消減cDNA文庫(kù)。2.4消減雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果用鮑β-actin特異性引物分別擴(kuò)增未消減和消減后的第2次PCR產(chǎn)物(圖4)。結(jié)果顯示,相同PCR循環(huán)參數(shù)下,對(duì)于未經(jīng)消減雜交的cDNA,23循環(huán)處即可見(jiàn)明顯產(chǎn)物條帶,而經(jīng)過(guò)消減雜交的cDNA,延遲10個(gè)循環(huán)后方可見(jiàn)PCR產(chǎn)物條帶,差異表達(dá)的基因均被富集了210倍左右,表現(xiàn)出較高的消減雜交效率(圖4)。2.5pcr檢測(cè)結(jié)果對(duì)隨機(jī)挑取的300個(gè)陽(yáng)性克隆用M13+/–引物進(jìn)行PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),有214個(gè)有效克隆,插入片斷長(zhǎng)度主要集中在0.2～1.0kb,與PCR消減結(jié)果基本相符(圖5)。2.6est序列同源性分析序列分析結(jié)果表明,所有測(cè)序的300個(gè)克隆中,86個(gè)克隆由于測(cè)序效果不佳或序列測(cè)序片段小于150bp的原因沒(méi)有得到相應(yīng)的序列,實(shí)際共獲得214個(gè)序列(81.3%)。序列相似性分析表明,所獲得的214個(gè)序列中,有163個(gè)克隆和GenBank中已知功能的序列具有同源性;30個(gè)則與未知功能的開放閱讀框具有較高相似性,稱之為假定蛋白;21個(gè)序列則沒(méi)有任何相似的序列,很有可能是以前沒(méi)有鑒定過(guò)的EST序列或是5′或3′-UTR序列。根據(jù)其編碼的多肽功能,可以將這些EST分成8類:細(xì)胞分裂、細(xì)胞結(jié)構(gòu)和運(yùn)動(dòng)、代謝、信號(hào)傳遞、細(xì)胞防御、蛋白質(zhì)和基因表達(dá)、其它(未發(fā)現(xiàn)相似序列基因)以及未知功能的假定蛋白(表2),共98個(gè)基因。分析發(fā)現(xiàn)代表這98個(gè)基因的EST序列,E值范圍主要集中在﹥-20,占74.1%(63/85)(表1),其中E值﹥-6的又占44.7%(38/85),表明在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中與本研究所得EST匹配的序列很少。這很有可能是由如下兩方面原因造成的,一是Genbank中貝類的EST的序列信息很少,很難找到與其同源性高的序列;二是消減所得EST為一些還沒(méi)有被檢測(cè)出來(lái)的新基因。3應(yīng)激蛋白基因的激活抑制性差減雜交是尋找差異表達(dá)基因的有效方法之一,通過(guò)此方法,差異表達(dá)基因可以有效富集。同F(xiàn)ujiki等在鯉(CyprinusCarpio)和Sangrador等在虹蹲(Oncorhynchusmykiss)中克隆出免疫調(diào)控相關(guān)基因相似,本研究首次采用抑制性消減雜交技術(shù)構(gòu)建了人工感染瘟病病毒后未死三角帆蚌肝臟差異表達(dá)的cDNA消減文庫(kù)。所構(gòu)建的文庫(kù)中差異表達(dá)基因均被富集了210倍左右,表現(xiàn)出較強(qiáng)的消減效率?！だm(xù)表2·在獲得的58個(gè)基因中,有10個(gè)與機(jī)體物質(zhì)和能量代謝相關(guān)的。如與物質(zhì)消化相關(guān)的基因Alpha-amylase,acrosin,similartoSialateO-acetylesteraseprecursor,cathepsinL等。其中,Alpha-amylase屬于糖苷水解酶家族,可將淀粉和其相關(guān)多糖最終水解成為葡萄糖;與物質(zhì)能量代謝有關(guān)的蛋白及酶基因similartoNADHdehydrogenase,possiblerubredoxin,peptidase,M23/M37family等。有研究表明,機(jī)體在受到外來(lái)微生物的入侵后,代謝出現(xiàn)紊亂,肝糖原分解增強(qiáng),脂肪分解加速,血糖升高,以適應(yīng)在應(yīng)急情況下對(duì)能量的需要?？梢?jiàn),大量代謝相關(guān)基因的產(chǎn)生,可能是三角帆蚌在受到瘟病病毒的入侵后,機(jī)體對(duì)能量需要的一種表現(xiàn)。研究表明:當(dāng)機(jī)體受到外來(lái)有害物質(zhì)侵襲時(shí),應(yīng)激蛋白可促進(jìn)機(jī)體免疫系統(tǒng)打開,對(duì)外來(lái)有害物質(zhì)進(jìn)行抑制,從而避免由于有害刺激而引起的細(xì)胞死亡。本研究所構(gòu)建的消減文庫(kù)中鑒定出部分與細(xì)胞防御相關(guān)的基因,如,應(yīng)激蛋白家族的成員theromacin和similartoPIT54。Theromacin是一種帶陽(yáng)離子的抗菌肽,對(duì)細(xì)菌有很強(qiáng)的抑制作用,其表達(dá)由外源病菌的入侵而被激活。PIT54蛋白是最先在紅原雞(G.gallus)中被發(fā)現(xiàn)的一種富含半胱氨酸的清道夫受體。在雞類和熱帶爪蟾中,PIT54是可以完全取代結(jié)合珠蛋白功能的急性期蛋白。因此,通過(guò)激活應(yīng)激蛋白基因,產(chǎn)生應(yīng)激蛋白的方式可能是三角帆蚌受到瘟病病毒侵犯時(shí)所采用的抵制或減少病原對(duì)機(jī)體傷害的方式之一。arginase,cytochromeP450和mucin是重要的抗腫瘤因子。腫瘤的快速增長(zhǎng)需要大量精氨酸,天然精氨酸酶可以通過(guò)將精氨酸水解成鳥氨酸和尿素方式抑制腫瘤生長(zhǎng)。cytochromeP450作用于環(huán)磷酞胺后,可被活化成細(xì)胞毒活性物質(zhì),從而發(fā)揮抗腫瘤作用。同時(shí),cytochromeP450激活的異環(huán)磷酞胺能引起細(xì)胞死亡,這對(duì)癌癥治療有重要意義。mucin是一種腫瘤相關(guān)抗原,能夠誘導(dǎo)細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞殺傷活性的表位肽,使人粘蛋白1可變數(shù)目連續(xù)重復(fù)區(qū)(MUC1VNTR)成為免疫治療的潛在靶點(diǎn)。本研究在構(gòu)建的消減文庫(kù)中克隆到一系列與抗腫瘤相關(guān)的基因,如,similartoarginasetypeI,similartoarginase、cytochromeP45030,trypsinogenRdoT3precursor,trypsin,mucin等?？梢?jiàn)三角帆蚌在受到瘟病病毒感染后,免疫系統(tǒng)也會(huì)大量的激活抗腫瘤相關(guān)基因,產(chǎn)生抗腫瘤活性蛋白,以避免腫瘤發(fā)生或降低腫瘤發(fā)生的