Na+K+-ATP酶活性測(cè)定試劑盒說明書

第第頁(yè)Na+K+—ATP酶活性測(cè)定試劑盒說明書Na+K+ATP酶活性測(cè)定試劑盒說明書微量法100管/48樣注意：正式測(cè)定前務(wù)必取23個(gè)預(yù)期差別較大的樣本做猜測(cè)定測(cè)定意義：Na+K+ATP酶廣泛分布于植物、動(dòng)物、微生物和細(xì)胞中，可催化ATP水解生成ADP和無機(jī)磷。測(cè)定原理：Na+K+ATP酶分解ATP生成ADP及無機(jī)磷，通過測(cè)定無機(jī)磷的量來確定ATP酶活性。需自備的儀器和用品:可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。試劑的構(gòu)成和配制：提取液：液體100mL×1瓶，4℃保管。試劑一：液體10mL×1瓶，4℃保管。試劑二：粉劑×1瓶，20℃保管；臨用前加入6mL蒸餾水充分混勻待用；用不完的試劑分裝后20℃保管，禁止反復(fù)凍融。試劑三：液體2mL×1瓶，4℃保管。試劑四：粉劑×1瓶，4℃保管。用時(shí)加入3mL蒸餾水，4℃保管。試劑五：粉劑×1瓶,4℃保管。用時(shí)加入25mL蒸餾水，溶解后4℃保管一周。試劑六：粉劑×1瓶,4℃保管。用時(shí)加入25mL蒸餾水，溶解后4℃保管一周。試劑七：液體25mL×1瓶，室溫保管。試劑八：10mmol/L標(biāo)準(zhǔn)磷儲(chǔ)備液10mL×1瓶，4℃保管。0.5μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液配制：將試劑八20倍稀釋，即取0.1mL試劑八加1.9mL蒸餾水充分混勻。定磷劑的配制：按H2O:試劑五:試劑六:試劑七=2:1:1:1的比例配制，配好的定磷劑應(yīng)為淺黃色。若無色則試劑失效，若是藍(lán)色則為磷污染，定磷劑現(xiàn)用現(xiàn)配。注意：配試劑最好用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避開磷污染。樣品酶液的制備：1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；依照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為500～1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波碎裂細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。組織：依照組織質(zhì)量（g）：提取液體積（mL）為1：5～10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。2、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。操作步驟：1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)整波長(zhǎng)至660nm，蒸餾水調(diào)零。2、酶促反應(yīng)（在EP管中加入下列試劑）對(duì)照管測(cè)定管試劑一（μL）6545試劑二（μL）6060試劑三（μL）20樣本（μL）100混勻，37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其他物種）準(zhǔn)確水浴10min試劑四（μL）2525樣本（μL）100混勻，8000g，25℃離心10min，取上清液3、定磷（在EP管或96孔板中加入下列試劑）空白管標(biāo)準(zhǔn)管對(duì)照管測(cè)定管0.5μmol/ml標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液（μL）20上清液（μL）2020蒸餾水（μL）20定磷試劑（μL）200200200200混勻，室溫放置30min，在660nm處，記錄各管吸光值。注意：1、由于每一個(gè)樣都必需做對(duì)照，本試劑盒100管保證測(cè)48份Na+K+ATP酶。2、此法具有微量、靈敏、快速的特點(diǎn)。所以對(duì)測(cè)定所用試管要求嚴(yán)格無磷。3、空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只要做一管。計(jì)算：1、血清（漿）Na+K+ATPase活力的計(jì)算:定義：每小時(shí)每毫升血清（漿）中Na+K+ATP酶分解ATP產(chǎn)生1μmol無機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。Na+K+ATP酶活力（μmol/h/mL）=[C標(biāo)準(zhǔn)管×V總]×（A測(cè)定管A對(duì)照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管A空白管）÷V樣÷T=7.5×（A測(cè)定管A對(duì)照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管A空白管）2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中Na+K+ATPase活力的計(jì)算：（1）按蛋白濃度計(jì)算：定義：每小時(shí)每毫克組織蛋白中Na+K+ATP酶分解ATP產(chǎn)生1μmol無機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。Na+K+ATP酶活力（μmol/h/mgprot）=[C標(biāo)準(zhǔn)管×V總]×（A測(cè)定管A對(duì)照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管A空白管）÷（Cpr×V樣）÷T=7.5×（A測(cè)定管A對(duì)照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管A空白管）÷Cpr（2）按樣本鮮重計(jì)算：定義：每小時(shí)每克組織中Na+K+ATP酶分解ATP產(chǎn)生1μmol無機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。Na+K+ATP酶活力（μmol/h/g鮮重）=[C標(biāo)準(zhǔn)管×V總]×（A測(cè)定管A對(duì)照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管A空白管）÷（W×V樣÷V樣總）÷T=7.5×（A測(cè)定管A對(duì)照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管A空白管）÷W（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：定義：每小時(shí)每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞中Na+K+ATP酶分解ATP產(chǎn)生1μmol無機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。Na+K+ATP酶活力（μmol/h/104cell）=[C標(biāo)準(zhǔn)管×V總]×（A測(cè)定管A對(duì)照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管A空白管）÷（500×V樣÷V樣總）÷T=0.015×（A測(cè)定管A對(duì)照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管A空白管）C標(biāo)準(zhǔn)管：標(biāo)準(zhǔn)管濃度，0.5μmol/