藻細(xì)胞色素對(duì)ppc-脫氫酶還原法測(cè)定藻細(xì)胞活性的影響

藻細(xì)胞色素對(duì)ppc-脫氫酶還原法測(cè)定藻細(xì)胞活性的影響

脫氫酶能酶促進(jìn)脫氫反應(yīng)，即酶促進(jìn)有機(jī)物質(zhì)的脫氫。由于脫氫酶是由活生物體產(chǎn)生,因此可用它來(lái)表達(dá)細(xì)胞體的活性。在脫氫酶活性檢測(cè)中,常用四唑氮衍生物作為人工受氫體,其中研究和應(yīng)用較多的是氯化三苯基四氮唑(TTC)。在脫氫酶還原反應(yīng)中,TTC被還原,生成三苯基甲臢(TPF),通過(guò)測(cè)定TPF的產(chǎn)生量,可判定脫氫酶活性的高低。TTC-脫氫酶還原法最早運(yùn)用于植物種子活性的鑒定,后來(lái)逐步用于植物的根系、莖葉和花粉等部位的活性檢測(cè)。除運(yùn)用在植物體外,TTC-脫氫酶還原法還可以用于動(dòng)物細(xì)胞活性的測(cè)試,以及運(yùn)用在細(xì)菌的活性測(cè)試上。在水處理過(guò)程中,TTC-脫氫酶還原法可測(cè)定活性污泥的活性。在藻活性研究方面,Chang等人用TTC-脫氫酶還原法測(cè)定了大型海藻帶石莼(Ulvafasciata)在不同鹽度環(huán)境下的活力狀況。但TTC-脫氫酶還原法運(yùn)用于淡水藻活性檢測(cè)方面,還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。由于藻華的頻繁發(fā)生,定量地描述藻細(xì)胞活性是水體富營(yíng)養(yǎng)化研究過(guò)程中非常有用的手段。銅綠微囊藻是引起水華的常見(jiàn)藻種,我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)TTC-脫氫酶還原法可以很好地用于銅綠微囊藻細(xì)胞活性的測(cè)定,但與測(cè)定動(dòng)物細(xì)胞或細(xì)菌活性不同,藻細(xì)胞中的色素可能會(huì)對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生一定的干擾。本文主要研究了藻細(xì)胞色素對(duì)活性測(cè)定干擾的影響程度,并對(duì)有機(jī)溶劑提取、有機(jī)溶劑萃取和加入堿液等方法降低色素干擾的效果進(jìn)行了研究,對(duì)TTC-脫氫酶還原法測(cè)定藻細(xì)胞活性進(jìn)行了優(yōu)化,確定了優(yōu)化的最佳適用條件。1其它試劑的制備1.1藻的培養(yǎng)銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa,FACHB915)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所,接種于MA培養(yǎng)基中,于30℃、2000lx和14h:10h(L:D)光暗條件下培養(yǎng),待進(jìn)入穩(wěn)定期后,開始實(shí)驗(yàn)。1.2主要試劑的配制0.2%TTC:稱取0.2gTTC溶于100mL三羥基甲基氨基甲烷(Tris)-HCl緩沖溶液中,pH為7.5,棕色試劑瓶保存,1周內(nèi)用完。0.05mol/LTris-HCl緩沖溶液:稱取12.1g三羥基甲基氨基甲烷溶于1000mL蒸餾水,濃度為0.1mol/L;取8.62mLHCl溶于1000mL蒸餾水中,濃度為0.1mol/L;將50mLTris溶液與40.3mLHCl溶液、9.7mL蒸餾水混合,得pH=7.5緩沖溶液。其它試劑:乙醇、丙酮、甲醇、正已烷、KOH和NaOH均為分析純。1.3實(shí)驗(yàn)操作1.3.1脫氫酶活性的測(cè)定取細(xì)胞密度為1.3×1010個(gè)/L的藻樣4mL,離心去除培養(yǎng)基,并用蒸餾水清洗2次,加入0.2%TTC溶液5mL,放置于35℃恒溫振蕩器中,在100r/min下振蕩培養(yǎng)24h。將培養(yǎng)后的藻樣離心,并用蒸餾水清洗2次,去除未反應(yīng)的TTC。于離心后的細(xì)胞沉淀中加入含0.001MKOH的50%乙醇溶液5mL,在室溫下放置30min,從細(xì)胞中提取TPF。然后加入3mL正已烷進(jìn)行萃取,用旋渦混合器(VDRTEX-5,江蘇海門其林貝爾儀器制造公司)處理1min,用紫外分光光度計(jì)(UV-VIS8500,上海天美科學(xué)儀器有限公司)測(cè)定正已烷萃取液在485nm處的吸光度值。1.3.2細(xì)胞色素的干擾及其去除取細(xì)胞密度為1.3×1010個(gè)/L的藻樣4mL,離心去除培養(yǎng)基,并用蒸餾水清洗2次,加入Tris-HCl緩沖溶液5mL,放置于35℃恒溫振蕩器中,在100r/min下振蕩培養(yǎng)24h。將培養(yǎng)后的藻樣離心,于離心后的細(xì)胞沉淀中加入有機(jī)提取劑5mL,在室溫下放置30min。然后加入3mL正已烷進(jìn)行萃取,用旋渦混合器處理1min。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定正已烷萃取液在485nm處的吸光度值。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,文中結(jié)果為3次平均值。2結(jié)果與分析2.1有機(jī)提取劑的用量銅綠微囊藻為單細(xì)胞體,屬于藍(lán)藻。由于沒(méi)有完整的細(xì)胞核,嚴(yán)格意義上藍(lán)藻并不屬于藻類,而是屬于原核生物,因此藍(lán)藻又被稱為藍(lán)細(xì)菌。藍(lán)藻中的色素主要包括葉綠素、胡蘿卜素、葉黃素和藻膽素等。TTC是無(wú)色且溶于水的化合物,在TTC脫氫酶還原反應(yīng)中,TTC被還原生成TPF,TPF為紅色不溶于水的化合物,以結(jié)晶形式存在于細(xì)胞內(nèi),因此需使用有機(jī)溶劑來(lái)破壞細(xì)胞壁及細(xì)胞膜,并從中提取出TPF進(jìn)行測(cè)定。在破壞細(xì)胞提取TPF的過(guò)程中,細(xì)胞中的色素不可避免地會(huì)從細(xì)胞中流出,進(jìn)入到提取液中。常用有機(jī)提取劑有甲醇、乙醇、異丙醇及丙酮等。如圖1所示在沒(méi)有加入TTC時(shí),直接用不同提取劑進(jìn)行提取時(shí)色素干擾的結(jié)果?？梢钥闯?除甲醇外,當(dāng)乙醇和丙酮濃度逐步升高時(shí),提取液在485nm處的吸光度值都明顯升高,當(dāng)提取劑濃度小于50%,吸光度值在0.13~0.35之間,當(dāng)提取劑濃度大于50%,吸光度值可達(dá)0.35~0.52,說(shuō)明增大有機(jī)提取劑的濃度,會(huì)增大色素的干擾。色素引起的吸光度值會(huì)嚴(yán)重干擾活性的測(cè)定,尤其在活性較小時(shí),色素會(huì)帶來(lái)較大的正誤差。2.2提取劑為正已烷時(shí)的吸光度為減少色素的影響,可以在用乙醇等提取劑提取TPF后加入有機(jī)萃取劑,進(jìn)行TPF的萃取,以去除部分色素。如圖2所示在沒(méi)有加入TTC時(shí),不同提取劑提取后用正已烷進(jìn)行萃取的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。與圖1結(jié)果相比,圖2中的吸光度值整體都有所下降,當(dāng)提取劑濃度大于50%時(shí),吸光度值降至0.14~0.32之間,大約下降了0.2,說(shuō)明用正已烷萃取后,部分色素遺留在提取劑溶液中,不過(guò)仍有部分色素會(huì)進(jìn)入到正已烷中。結(jié)果還顯示,當(dāng)提取劑濃度升高時(shí),正已烷中的色素濃度仍會(huì)有所升高,但3種提取劑正已烷萃取液的吸光度值相關(guān)不大,表明3種提取劑對(duì)正已烷的萃取效果影響不大。2.3提取劑濃度的確定TPF為非極性有機(jī)物,極易溶于有機(jī)溶液中。如圖3結(jié)果顯示,當(dāng)提取劑濃度低于50%時(shí),正已烷萃取液的吸光度值較低,說(shuō)明低濃度提取劑的提取效率較低。對(duì)于乙醇和丙酮,提取劑濃度必須大于50%,甲醇濃度大于60%,正已烷萃取液的吸光度值才會(huì)明顯上升。但當(dāng)提取劑濃度大于80%后,正已烷萃取液的吸光度值又出現(xiàn)明顯下降。實(shí)驗(yàn)觀察到,當(dāng)提取劑濃度高于80%后,出現(xiàn)了提取劑與正已烷之間的互溶,部分正已烷溶解于提取劑溶液中,影響了萃取效果,而且提取劑濃度的升高,也會(huì)降低有機(jī)溶劑液液萃取的效率。因此在TPF提取過(guò)程中,提取劑濃度為50%~80%時(shí)能獲得較好的提取效果。相比于甲醇和丙酮,乙醇的毒性較低,因此在以下實(shí)驗(yàn)中選擇乙醇作為提取劑。當(dāng)用5mL50%~80%乙醇進(jìn)行提取后,用3mL正已烷進(jìn)行TPF萃取,發(fā)現(xiàn)1次萃取率可以達(dá)到99%以上,無(wú)需進(jìn)行2次萃取。2.4乙醇和koh對(duì)萃取效果的影響色素在堿性溶液中不穩(wěn)定,易受到破壞。為了解堿性溶液是否能降低色素的干擾,在乙醇提取劑中添加一定量的堿性物質(zhì)后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。見(jiàn)圖4和圖5分別為不加入TTC反應(yīng)時(shí),在用含KOH和NaOH乙醇提取后,正已烷萃取液的吸光度值。結(jié)果顯示,在乙醇中添加一定量堿性物質(zhì)后,正已烷萃取液的吸光度值都出現(xiàn)了明顯的下降。當(dāng)乙醇濃度大于50%時(shí),加入KOH,萃取液吸光度值可從0.14~0.30下降至0.04~0.26,加入NaOH,萃取液吸光度值可下降至0.03~0.19,吸光度值平均下降0.1左右。說(shuō)明堿性溶液可以去除部分色素干擾,NaOH去除效果略好于KOH,不過(guò)兩者濃度對(duì)色素去除的影響不是很大。但與圖1實(shí)驗(yàn)結(jié)果有所不同,堿性乙醇濃度升高,色素所產(chǎn)生吸光度值升高,由于50%~80%乙醇提取TPF效果相當(dāng),因此在去除色素干擾中以50%乙醇濃度為最佳。2.5koh和naoh對(duì)tpf的影響堿性物質(zhì)可以破壞細(xì)胞色素,也可能會(huì)破壞TPF。為了解KOH和NaOH對(duì)TPF的影響,實(shí)驗(yàn)對(duì)堿性提取劑提取TPF的效果進(jìn)行了研究。如圖6和圖7所示,增大KOH和NaOH濃度會(huì)明顯降低正已烷萃取液的吸光度值,而且隨著提取劑濃度的增大,吸光度值下降越大。乙醇濃度為50%,不加入KOH和NaOH時(shí),吸光度值為1.18,加入0.001MKOH或NaOH后,吸光度值略有下降,分別為1.07和1.04,約下降0.12,這個(gè)下降值可以認(rèn)為是由于細(xì)胞色素被堿液去除所引起,TPF的減少量很小。但當(dāng)加入0.2MKOH或NaOH后,吸光度值下降至0.89和0.71,約下降了0.4,高于色素下降值,說(shuō)明較高的堿濃度會(huì)破壞TPF,導(dǎo)致TPF的損失。由此可見(jiàn),加入0.001M~0.01M的KOH或NaOH,可以有效地去除色素,但又不影響TPF的穩(wěn)定。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,可以看到,當(dāng)使用50%乙醇作為提取劑時(shí),采用正已烷進(jìn)行萃取,色素所致吸光度值可從0.45降至0.14;通過(guò)50%乙醇(含0.001M~0.01MKOH或NaOH)進(jìn)行提取,色素所致吸光度值可從0.14降至0.04,基本將色素干擾去除。3提取劑為2.35.5%的藻樣活性測(cè)定(1)乙醇、甲醇和丙酮提取TPF的效果相差不大,乙醇和丙酮提取劑的最佳濃度范圍是5