中藥復(fù)方對(duì)慢性約束應(yīng)激大鼠下丘腦內(nèi)啡肽的影響

中藥復(fù)方對(duì)慢性約束應(yīng)激大鼠下丘腦內(nèi)啡肽的影響

作為一種重要的抗癲癇藥物，它在大腦中很常見。主要分布在大腦、杏仁核和中隔。乾隆年間，也有大面積的神經(jīng)退行性疾病，但沒有神經(jīng)退行性疾病。在垂體中期和前部，呈濃度較高的垂直組織中的腎上腺、胃關(guān)節(jié)、脾臟和胎盤。在疼痛和應(yīng)激反應(yīng)中,β-EP從垂體前葉釋放至循環(huán)中,但它很快被血液蛋白酶所降解。血漿β-EP是下丘腦、垂體分泌的一種神經(jīng)內(nèi)分泌激素,在應(yīng)激反應(yīng)時(shí)增高。前期實(shí)驗(yàn)用放射免疫方法檢測(cè)大鼠下丘腦β-EP的變化及中藥復(fù)方的影響,結(jié)果21天模型組其含量明顯上升,而中藥復(fù)方能逆轉(zhuǎn)這種變化。在此基礎(chǔ)上,本實(shí)驗(yàn)選用免疫組織化學(xué)結(jié)合圖像分析技術(shù),進(jìn)一步觀察大鼠下丘腦β-EP的變化及中藥復(fù)方的調(diào)節(jié)作用。材料和方法1.實(shí)驗(yàn)分組及模型構(gòu)建SD雄性大鼠,體重為(200±20)g,購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心,合格證號(hào):SCXK-京2002-0003。大鼠適應(yīng)3天后開始分組,進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組:A組,正常對(duì)照組;B組,7天模型組;C組,21天模型組;D組,模型加逍遙散防治組(簡(jiǎn)稱逍遙散組,下同);E組,模型加四君子湯防治組(簡(jiǎn)稱四君子湯組,下同);F組,模型加金匱腎氣丸防治組(簡(jiǎn)稱腎氣丸組,下同)。每組各10只動(dòng)物,每籠5只群養(yǎng),飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物房,室內(nèi)溫度保持為(22±2)℃,相對(duì)濕度保持為30%～40%,各組大鼠喂常規(guī)飼料,自由進(jìn)食飲水。2.君子湯、金保持丸、金充氣丸制備實(shí)驗(yàn)所用的中藥復(fù)方分別選用《太平惠民和劑局方》中的逍遙散(北柴胡15g,當(dāng)歸15g,白芍15g,白術(shù)15g,茯苓15g,炙甘草7.5g,生姜5g,薄荷5g);四君子湯(黨參15g,白術(shù)7.5g,茯苓7.5g,炙甘草5g)和《金匱要略》中的金匱腎氣丸(干地黃30g,山藥15g,山茱萸5g,澤瀉7.5g,茯苓7.5g,牡丹皮7.5g,桂枝5g,炮附子5g)。上述中藥飲片均購自北京同仁堂藥店,由中日友好醫(yī)院制劑室嚴(yán)格按照工藝制成藥粉備用,用時(shí)根據(jù)需要用蒸餾水配制成一定的濃度。3.動(dòng)物的飼養(yǎng)與飼養(yǎng)大鼠束縛架為木制結(jié)構(gòu)。底座寬10cm,長(zhǎng)20cm,厚1cm,上面束縛臺(tái)長(zhǎng)22cm,寬6.6cm,前端有固定大鼠頭部的小架,兩邊有適合四肢放置的凹槽,上端有兩條可調(diào)節(jié)的軟帶,分別固定大鼠的胸部和腰部。大鼠飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物房,每籠5只,自然光照,每日每籠大鼠給300g飼料。以慢性束縛方法制作應(yīng)激大鼠模型,將大鼠束縛于特制的鼠束縛架上,每日3h,共3周。4.免疫組化染色給藥方法:自造模第1日始,D、E、F組每日分別灌服逍遙散、四君子湯、金匱腎氣丸,按人體用藥量換算成大鼠等效劑量作為大鼠用藥量,3組的給藥量分別為5.82g/kg、2.62g/kg和4.89g/kg,灌胃容積為1ml/100g體重,并根據(jù)體重隨時(shí)調(diào)整給藥量。A、B、C組則灌服等體積的蒸餾水。B組于第1周后取材,其他各組3周后取材。造模過程中,注意觀察大鼠外觀形態(tài)、進(jìn)食量及體重等變化。取材:造模3周后,將大鼠稱重,各組大鼠用10%水合氯醛麻醉后(劑量300mg/kg),經(jīng)左心室至升主動(dòng)脈插管快速灌入冷的200ml生理鹽水,繼以冷的4%多聚甲醛300ml灌注固定。在放有冰塊的搪瓷盤中迅速剪開大鼠顱骨,取出腦組織,置10%甲醛中,4h后放入20%的蔗糖中,待組織下沉。用LEICA-CM1900型衡冷低溫切片機(jī)取冠狀切片,片厚50μm,留取包括背側(cè)海馬最大斷面和頂葉皮質(zhì)的切片,裱貼于預(yù)先經(jīng)10%多聚賴氨酸(購自北京中山生物技術(shù)有限公司)處理過的載玻片上,空氣中干燥后置于-70℃冰箱中。免疫組織化學(xué)染色程序:采用SP法。切片經(jīng)室溫平衡后主要步驟如下:10%的正常山羊血清室溫孵育30min,封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn);傾去羊血清,加入用1%BSA稀釋后的兔抗β-EP(稀釋度1∶100,Sigma公司產(chǎn)品),37℃孵育1h,然后4℃孵育72h;用0.01mol/L的PBS漂洗3次,每次5min;加入生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG(北京中山生物技術(shù)有限公司),室溫孵育30min;用0.01mol/L的PBS漂洗3次,每次5min;加入鏈霉素卵白素標(biāo)記的HR,室溫孵育30min;用0.01mol/L的PBS漂洗3遍,每次5min;加入DAB顯色試劑,鏡下控制顯色時(shí)間;充分漂洗、干燥后用中性樹膠封片。置換實(shí)驗(yàn):用正常兔血清代替第1級(jí)抗體孵育切片?？瞻讓?shí)驗(yàn):省去第1級(jí)抗體,以PBS代替孵育切片。圖像分析:采用TN-8520型圖像分析系統(tǒng)(美國(guó)TracorNorthern公司),對(duì)糖皮質(zhì)激素受體(GR)免疫陽性細(xì)胞進(jìn)行定量檢測(cè)。每組隨機(jī)測(cè)試6張切片,每個(gè)部位測(cè)試1個(gè)視野分別測(cè)量。所有切片均在同一放大倍數(shù)(10×20)、同一光強(qiáng)度下分析,每張切片分別測(cè)定海馬CA1區(qū)、齒狀回、大腦皮質(zhì)Ⅳ、Ⅴ層,各測(cè)相同面積內(nèi)的陽性反應(yīng)細(xì)胞。分析:陽性反應(yīng)細(xì)胞平均總面積(particlearea,μm2);陽性反應(yīng)細(xì)胞平均光密度(meanopticaldensity,MOD);陽性反應(yīng)細(xì)胞數(shù)(numberofparticle)。5.組間差異統(tǒng)計(jì)分析統(tǒng)計(jì)學(xué)分析運(yùn)用Excel、SPSS等軟件進(jìn)行,數(shù)據(jù)以xˉ±sxˉ±s表示。組間差異采用方差分析(ANOVA);以P<0.05作為差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的界限。大鼠機(jī)械模型的表達(dá)1.β-EP免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元的一般形態(tài)與分布β-EP陽性纖維和終末在大腦和間腦內(nèi),顏色呈棕黃色,主要位于胞漿內(nèi),胞核著色較淺,背景顏色更淺;陽性反應(yīng)細(xì)胞多分布在隔區(qū)、杏仁核和下丘腦的室周核、弓狀核、背內(nèi)側(cè)核以及腹內(nèi)側(cè)核。2.下丘腦β-EP免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞平均光密度、平均總面積、平均細(xì)胞數(shù)目比較與正常組(A組)相比,7天模型組(B組)未見明顯差異,21天模型組(C組)大鼠下丘腦β-EP免疫反應(yīng)強(qiáng)度、陽性細(xì)胞數(shù)目及陽性細(xì)胞平均總面積均明顯增強(qiáng)、增多、增大;與21天模型組(C組)比較,逍遙散組(D組)及腎氣丸組(F組)能顯著降低下丘腦β-EP免疫反應(yīng)陽性強(qiáng)度,減少下丘腦β-EP免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)目,減小下丘腦β-EP免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞平均總面積;而四君子湯組(E組)與21天模型組比較沒有明顯差異。見表1。3.對(duì)照實(shí)驗(yàn)以正常兔血清代替第1級(jí)抗體孵育切片和以PBS代替第1級(jí)抗體均為陰性反應(yīng)。血漿-內(nèi)啡肽和腦啡肽應(yīng)激失調(diào)可引起心身疾病和精神疾病,但與機(jī)體的素質(zhì)(體質(zhì)、健康狀態(tài))有很大關(guān)系。當(dāng)人們面對(duì)強(qiáng)大的精神刺激,不幸的生活遭遇和不能調(diào)節(jié)自己時(shí),某些人出現(xiàn)軀體方面疾病,而某些人則出現(xiàn)精神神經(jīng)疾病。對(duì)機(jī)體的損害主要表現(xiàn)在心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和神經(jīng)精神系統(tǒng)這四個(gè)系統(tǒng)。其中神經(jīng)精神系統(tǒng)疾病主要包括幾個(gè)類型:心身疾病、神經(jīng)官能癥、精神分裂癥和有關(guān)的精神病、躁狂—抑郁病。阿片肽是1975年發(fā)現(xiàn)的第一種肽類神經(jīng)遞質(zhì),它包括內(nèi)啡肽、腦啡肽(enkephalin,EnK)和強(qiáng)啡肽(dynorphin,DYN)等。目前已有許多實(shí)驗(yàn)證明阿片肽在免疫調(diào)節(jié)中有重要作用,甚至有人稱這類肽為神經(jīng)免疫肽。它的主要功能可能是機(jī)體在各種應(yīng)激條件下,通過心血管、疼痛和免疫功能的作用在更高的水平上作復(fù)雜的調(diào)節(jié),使機(jī)體保持穩(wěn)態(tài)。許多應(yīng)激原(手術(shù)、分娩、電剌激、注射內(nèi)毒素、放血、脊髓損傷等)都可引起人血漿β-內(nèi)啡肽明顯增多,達(dá)正常的5～10倍。血漿β-內(nèi)啡肽水平的升高程度與促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)平行。β-內(nèi)啡肽和ACTH(含39個(gè)氨基酸殘基)、α-MSH(黑細(xì)胞刺激素)是同一前體阿片樣肽黑素皮質(zhì)激素原(proopiomelanocortin,POMC)的衍生物。β-內(nèi)啡肽和ACTH都在下丘腦CRF的剌激下分泌入血,都受血漿糖皮質(zhì)激素的反饋調(diào)節(jié)。輸入β-內(nèi)啡肽可降低血中ACTH和皮質(zhì)醇的水平,而輸入阿片受體拮抗藥納絡(luò)酮(naloxone)則能使血中ACTH、β-促脂解激素(β-lipotropin,β-內(nèi)啡肽的前體)和皮質(zhì)醇的水平升高,提示β-內(nèi)啡肽能調(diào)節(jié)ACTH的分泌,并且與ACTH一起經(jīng)過短反饋或長(zhǎng)反饋回路來抑制下丘腦CRF的分泌。β-內(nèi)啡肽有很強(qiáng)的鎮(zhèn)痛作用。應(yīng)激鎮(zhèn)痛(應(yīng)激時(shí)痛閾值的升高)可部分地為納絡(luò)酮所取消,可能與β-內(nèi)啡肽增多有關(guān)。β-內(nèi)啡肽與腦啡肽、強(qiáng)啡肽合為阿片肽,其經(jīng)典功能是內(nèi)源性鎮(zhèn)痛作用,它還介導(dǎo)應(yīng)激對(duì)諸如情緒、精神狀態(tài)的影響,這一現(xiàn)象亦受到學(xué)者們的廣泛關(guān)注。大量的研究資料表明,內(nèi)阿片系統(tǒng)及其受體在應(yīng)激調(diào)節(jié)中起著不可忽視的作用。研究證明,腦內(nèi)含β-EP的陽性神經(jīng)元胞體主要存在于下丘腦的弓狀核和孤束核的尾側(cè)部,其纖維可以投射到腦內(nèi)的許多部位。神經(jīng)元在胞體內(nèi)先合成β-EP的前體物質(zhì)——阿黑皮素原,在軸突運(yùn)輸過程中,經(jīng)多個(gè)步驟再加工成有活性的β-EP,儲(chǔ)存于神經(jīng)纖維和終末的大顆粒小泡內(nèi)。當(dāng)受到應(yīng)激、損傷等刺激時(shí),β-EP釋放,并和腦內(nèi)的阿片受體結(jié)合產(chǎn)生效應(yīng)。由此看出,β-EP在腦內(nèi)神經(jīng)纖維、終末的分布及含量的變化可間接反應(yīng)β-EP在腦內(nèi)的合成和釋放狀況。內(nèi)啡肽在不同形式的應(yīng)激中,主要在血液動(dòng)力學(xué)和內(nèi)分泌起重要作用。有實(shí)驗(yàn)報(bào)道電擊足底應(yīng)激時(shí),血漿β-內(nèi)啡肽含量顯著升高,而下丘腦、室周組織、垂體前葉中的β-內(nèi)啡肽含量均下降。從而提示是否對(duì)于不同外界刺激會(huì)影響不同部位β-內(nèi)啡肽水平,同時(shí)束縛應(yīng)激對(duì)此影響是否有一定的時(shí)程特性。內(nèi)源性阿片肽與下丘腦—垂體—腎上腺軸(HPA軸)關(guān)系密切,其中在垂體水平與β-內(nèi)啡肽與ACTH來源于同一前體,共受下丘腦促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRF)類物質(zhì)的調(diào)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與正常組相比,