利用靈芝發(fā)酵中藥的研究

利用靈芝發(fā)酵中藥的研究

中國的中醫(yī)藥歷史悠久，中醫(yī)資源豐富，為確保廣大人民群眾的身體健康發(fā)揮了巨大作用。但近幾十年來,我國在中藥現(xiàn)代化方面進展緩慢,其中原因之一就是中藥加工技術(shù)陳舊,近來有學者提出了中藥發(fā)酵制藥技術(shù)。藥用真菌是中藥的組成部分,它們中的許多種類都能以液體發(fā)酵進行生產(chǎn),以適當?shù)闹兴帪榕囵B(yǎng)基或在培養(yǎng)基中添加適量的中藥,利用它們強大的分解轉(zhuǎn)化能力,不僅可對中藥中的纖維、糖類和蛋白等物質(zhì)加以利用,而且在代謝過程中可能對中藥中的一些成分進行轉(zhuǎn)化,從而提高中藥活性成分在復合制劑中的比例及效價;另外中藥中的某些成分亦能促進藥用真菌的生長或活性產(chǎn)物的產(chǎn)生,這樣可生產(chǎn)出包含多種活性成分且藥效較簡單組方配伍更佳的新型發(fā)酵制劑,為此,本實驗室開展了利用靈芝等藥用真菌對中藥進行發(fā)酵的研究,首先對適合靈芝發(fā)酵的中藥進行了篩選。本文報道了部分中藥對靈芝在液體培養(yǎng)中生長(生物量)及代謝產(chǎn)物(胞外多糖)的影響,為利用靈芝進行中藥發(fā)酵提供基礎(chǔ)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1細菌靈芝(Ganodermalucidum),由江南大學生物工程學院生物資源研究室篩選保存。1.1.2皮粉、豆餅粉添加量種子培養(yǎng)基:每升含葡萄糖20g,玉米粉10g,麩皮粉5g,豆餅粉5g。發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基:每升含葡萄糖40g,蛋白胨4g,MgSO40.75g,KH2PO41.5g,VB10.01g,pH6.5。1.1.3山禾藥企業(yè)來源黃芪(Astragalusmembranaceus)、薏苡仁(Coixlachryma-jobi)、枸杞子(Lyciumbarbarum)、當歸(Angelicasinensis)、玄參(Scrophularianingpoensis)、山藥(Dioscoreaopposita)、黨參(Codonopsispilosula)、牛膝(Achyranthesbidentata)和石斛(Dendrobiumnobile)均購自江蘇無錫山禾藥業(yè)集團。蘆薈(Aloevera)為鮮葉曬干自制。1.2藥汁的制備稱取中藥材(已切片),加6倍量水浸泡1h,用電爐煎熬,調(diào)整適當?shù)募訜釡囟?使保持溫和的沸騰狀態(tài)。煮沸30min,倒出藥汁,補加適量冷水于藥渣中,再煮沸20min,倒出藥汁。合并藥汁(控制至適當體積),過濾,以3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylicacid,DNS)法測定藥汁中還原糖含量,藥汁用于靈芝液體培養(yǎng)。1.3藥汁還原糖含量測定稱取一定量中藥材,加10倍量70%乙醇浸提48h,過濾,減壓蒸去乙醇,再加水至適當體積,靜置24h,過濾,以DNS法測定藥汁中還原糖含量,藥汁用于靈芝液體培養(yǎng)。1.4不同還原糖溶液的接種將72mL藥汁倒入250mL三角瓶中,加入發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基(控制各試驗樣品與對照樣品中還原糖濃度相同),每個樣品設(shè)3個重復。121℃滅菌30min。冷卻后接入靈芝液體種,接種量10%。搖瓶條件:三角瓶250mL,裝液量80mL,30℃150r/min培養(yǎng)7d。1.5生物量計算將發(fā)酵液離心(4000r/min,10min),沉淀用水洗兩次,再離心,沉淀在105℃烘干至恒重,稱重得生物量。1.6加65%乙醇-乙醇法發(fā)酵液經(jīng)離心所得的上清液合并,減壓濃縮到發(fā)酵液體積的2/5～3/5,加95%酒精到乙醇含量為30%,在冰箱中靜置24h。離心,棄去沉淀,上清液再加95%乙醇到乙醇含量達到60%,在冰箱中靜置24h。離心,沉淀用蒸餾水溶解并定容到25mL,用苯酚-硫酸法測多糖含量。2結(jié)果2.1不同水提液對不同從根本上影響巖石家系中巖石多糖含量的影響取黃芪等10味中藥各15g,制成水提液后,研究其對靈芝液體發(fā)酵生物量及胞外多糖的影響,結(jié)果見表1。其中對照為在不添加中藥的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中發(fā)酵的結(jié)果,其它條件相同。由表1可見,在每升培養(yǎng)基為187.5g生藥量的劑量下,除黃芪外,薏苡仁、枸杞子、當歸、玄參、山藥、黨參、牛膝、石斛和蘆薈的水提液均能促進靈芝的生長(生物量增加),以牛膝、山藥效果顯著,生物量分別為對照的2.35和2.12倍;在胞外多糖方面,加入中藥水提液的發(fā)酵樣比對照高2.46～9.22倍,抑制靈芝生長的黃芪水提樣亦比對照高3.3倍,中藥中某些成分雖可促進靈芝胞外多糖的分泌,但這一結(jié)果更可能是中藥水提液中本身中藥多糖的含量高。為排除中藥本身多糖的干擾,我們研究了中藥醇提液對靈芝液體發(fā)酵的影響。2.2不同的醇提液對不同生物量感官的影響取薏苡仁等6味中藥各15g,制成醇提液后,研究其對靈芝液體發(fā)酵生物量及胞外多糖的影響(表2)。結(jié)果顯示,在每升培養(yǎng)基為187.5g生藥量的劑量下,薏苡仁、山藥、黨參和牛膝的醇提液能促進靈芝的生長,生物量分別比對照增加1.74～2.23倍,對靈芝胞外多糖的分泌亦有不同程度的提高;而當歸和石斛的醇提液顯著抑制靈芝的生長,但能促進靈芝胞外多糖的分泌。2.3不同的醇提液對不同生物量感官的影響為了觀察中藥量的變化對靈芝發(fā)酵的影響,分別取5、10、15和20g的當歸、石斛、黨參和牛膝制成醇提液,研究了其對靈芝生物量及胞外多糖的影響(圖1和圖2)。結(jié)果表明,當歸和石斛的醇提液對靈芝生物量的抑制成劑量效應(yīng),但不同劑量的當歸、石斛醇提液均能不同程度地促進靈芝胞外多糖的分泌。黨參和牛膝的醇提液在較低劑量(<187.5g生藥量/L培養(yǎng)基)能促進靈芝生物量及胞外多糖的增加;黨參在較高劑量(>250g生藥量/L培養(yǎng)基)促進靈芝生長的作用下降,而牛膝則抑制靈芝的生長,但它們都不抑制靈芝胞外多糖的分泌。3不同中藥的活性成分和活性代謝產(chǎn)物的制備工藝靈芝是我國傳統(tǒng)名貴中藥,現(xiàn)代藥理學研究表明其功效顯著,近年來利用液體深層發(fā)酵生產(chǎn)靈芝活性成分的技術(shù)日趨成熟。中藥材本身含有多種活性成分,而且其中的某些成分可促進靈芝的生長或代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)。靈芝酶活力強,利用其強大的分解轉(zhuǎn)化能力,以中藥為培養(yǎng)基或在培養(yǎng)基中添加適量中藥,可能對中藥中的某些成分進行轉(zhuǎn)化,降低中藥的毒副作用或提高其效價。將現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)與中藥材的加工進行有機的結(jié)合,利用靈芝等藥用真菌對中藥材進行發(fā)酵,可生產(chǎn)包含中藥活性成分、靈芝菌體及其活性代謝產(chǎn)物且藥效較簡單組方配伍更佳的新型制劑。本文研究了黃芪、薏苡仁、枸杞子、當歸、玄參、山藥、黨參、牛膝、石斛和蘆薈的提取液對靈芝發(fā)酵的影響,除黃芪外,其它中藥的水提液均能促進靈芝的生長;薏苡仁、山藥、黨參和牛膝的醇提液亦能促進靈芝生物量的增加,但當歸和石斛的醇提液則抑制靈芝生長,且呈劑量關(guān)系。在所試驗的中藥中,利用靈芝對薏苡仁、枸杞子、山藥、黨參和牛膝進行發(fā)酵加工