脂質(zhì)體的研究進展

脂質(zhì)體的研究進展

1脂質(zhì)體的分類和應(yīng)用脂質(zhì)體是指將藥物密封在雙分子層中形成的小型囊泡（vesigno）。它也被稱為脂質(zhì)體、球形或微囊。類脂質(zhì)雙分子層厚度約4nm。英國Rymen等于1971年開始制成脂質(zhì)體。后來人們根據(jù)脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)分類,主要是根據(jù)脂質(zhì)體所包含類脂質(zhì)雙分子層的層數(shù)分為單室脂質(zhì)體和多室脂質(zhì)體。含有單一雙分子層的囊泡稱為單室脂質(zhì)體或小單室脂質(zhì)體,粒徑約20～80nm,也可稱納米脂質(zhì)體;大單室脂質(zhì)體為單層大囊泡,粒徑在0.1～1μm之間;含有多層雙分子層的囊泡稱為多室脂質(zhì)體,粒徑在1～5μm之間。其中每層均可包封藥物,水溶性藥物包封于囊泡的親水基團夾層中,而脂溶性藥物則分散于囊泡的疏水基團的夾層中。大單室脂質(zhì)體包封的藥物量可比小單室脂質(zhì)體多10倍。當(dāng)前脂質(zhì)體的研究主要集中在3個領(lǐng)域:模擬膜的研究;制劑的可控釋放和在體內(nèi)靶向給藥;在體外培養(yǎng)中將基因和其他物質(zhì)向細胞內(nèi)傳遞。近年已上市的品種有多柔比星脂質(zhì)體、兩性霉素B脂質(zhì)體、柔紅霉素脂質(zhì)體及慶大霉素脂質(zhì)體等,臨用前加入藥物振搖即可應(yīng)用的空白脂質(zhì)體也已上市。1.1脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)鑒定脂質(zhì)體的組成、結(jié)構(gòu)與表面活性劑構(gòu)成的膠束不同,后者是由單分子層所組成,而脂質(zhì)體則由雙分子層所組成。脂質(zhì)體的主要組成成分是磷脂和膽固醇。磷脂為兩性物質(zhì),含有一個磷酸基和一個季銨鹽基,均為親水性基團,還有兩個較長的烴基為疏水鏈。膽固醇亦屬于兩親物質(zhì),其結(jié)構(gòu)中亦具有疏水與親水兩種基團,其疏水性較親水性強。用磷脂與膽固醇作脂質(zhì)體的膜材時,必須用有機溶劑先將其配成溶液,然后蒸發(fā)除去有機溶劑,在器壁上形成均勻的薄膜,此薄膜是由磷脂與膽固醇混合分子相互間隔定向排列的雙分子層所組成。磷脂與膽固醇交叉排列,由磷脂分子的極性端與膽固醇分子的極性基團相結(jié)合,故親水基團上接有兩個疏水鏈,其中一個疏水鏈?zhǔn)橇字肿又械膬蓚€烴基,另一個是膽固醇結(jié)構(gòu)中的疏水鏈。磷脂分子形成脂質(zhì)體時,具有兩條疏水鏈指向內(nèi)部,親水基在膜的內(nèi)外兩個表面上,磷脂雙層構(gòu)成一個封閉小室,內(nèi)部包含水溶液,小室中水溶液被磷脂雙層包圍而獨立,磷脂雙室形成囊泡又被水相介質(zhì)分開。脂質(zhì)體可以是單層的封閉雙層結(jié)構(gòu),也可以是多層的封閉雙層結(jié)構(gòu)。在電鏡下,脂質(zhì)體的外形常見的有球形、橢圓形等,直徑從幾十納米到幾微米之間,單室脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)見圖1。1.2相變溫度及膜孔結(jié)構(gòu)1.2.1相變溫度脂質(zhì)體的物理性質(zhì)與介質(zhì)溫度有密切關(guān)系,當(dāng)升高溫度時脂質(zhì)體雙分子層中疏水鏈可從有序排列變?yōu)闊o序排列,從而引起一系列變化,如膜的厚度減小,流動性增加以及通透性、融合、聚集和結(jié)合蛋白質(zhì)等生物學(xué)性質(zhì)的改變等。轉(zhuǎn)變時的溫度稱為相變溫度(Tc),可采用差示掃描量熱法、電子自旋共振光譜等測定,它取決于磷脂的種類。脂質(zhì)體膜可以由兩種以上磷脂組成,它們各有特定的相變溫度,在一定條件下它們可同時存在不同的相。1.2.2膜的流動性膜的流動性是脂質(zhì)體的一個重要物理性質(zhì),膜的流動性大.脂質(zhì)體的穩(wěn)定性就小、藥物釋放快。通常在磷脂中加入流動性緩沖劑膽固醇,在高于相變溫度時可降低脂質(zhì)體膜的流動性,提高脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。1.2.3電性酸性脂質(zhì)如磷脂酸和磷脂酰絲氨酸等的脂質(zhì)體荷負電,含堿基(氨基)脂質(zhì)如十八胺等的脂質(zhì)體荷正電,不含離子的脂質(zhì)體顯電中性。脂質(zhì)體表面電性與其載藥量、包封率、穩(wěn)定性、靶器官分布及對靶細胞作用有關(guān)。表面電性可采用熒光法或顯微電泳法測定。1.3包封成脂質(zhì)體的作用脂質(zhì)體具有包封脂溶性藥物或水溶性藥物的特性,藥物被脂質(zhì)體包封后,具有以下主要特點:1.3.1靶向性脂質(zhì)體經(jīng)靜注進入體內(nèi)可被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的巨噬細胞作為外界異物而吞噬,濃集于巨噬細胞豐富的肝、脾和骨髓。如抗肝利什曼原蟲藥銻酸葡胺被脂質(zhì)體包封后,藥物在肝臟中的濃度提高200～700倍,可治療利什曼病等網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)疾病。脂質(zhì)體經(jīng)肌內(nèi)、皮下、腹腔注射后,首先進入局部淋巴結(jié)中,是治療和預(yù)防腫瘤擴散和轉(zhuǎn)移的優(yōu)良藥物載體。脂質(zhì)體雖有靶向性,但其靶向性的專一性不夠。1.3.2緩釋性許多藥物在體內(nèi)由于迅速代謝或排泄,故作用時間短。將藥物包封成脂質(zhì)體,可減少腎排泄和代謝而延長藥物在血液中的滯留時間,使藥物在體內(nèi)緩慢釋放,從而延長了藥物的作用時間。藥物從多室脂質(zhì)體釋放需要向外透過多層磷脂膜,所以藥物從多室脂質(zhì)體釋放比相同組分的單室脂質(zhì)體為慢。利用脂質(zhì)體緩慢釋放藥物的機制可以有效地延長藥物在體內(nèi)的半衰期。如按6mg·kg-1劑量靜注多柔比星和多柔比星脂質(zhì)體,兩者在體內(nèi)過程均符合三室模型,兩者的消除半衰期分別為17.3h和69.3h。表明脂質(zhì)體的緩釋性好。1.3.3細胞親和性與組織相容性因脂質(zhì)體是類似生物膜結(jié)構(gòu)的囊泡,對正常細胞和組織無損害和抑制作用,有細胞親和性與組織相容性,并可長時間吸附于靶細胞周圍,使藥物能充分向靶細胞靶組織透過,脂質(zhì)體也可通過融合進入細胞內(nèi),經(jīng)溶酶體消化釋放藥物。如將抗結(jié)核藥物包封于脂質(zhì)體中,可將藥物載入細胞內(nèi)殺死結(jié)核菌,提高療效。1.3.4降低藥物毒性藥物被脂質(zhì)體包封后,主要被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的巨噬細胞所吞噬而攝取,濃集于肝、脾等器官,而使藥物在心、腎中累積量比游離藥物低得多,因此如將對心、腎有毒性的藥物或?qū)φ＜毎卸拘缘目拱┧幇獬芍|(zhì)體,可明顯降低藥物的毒性。如兩性霉素B,它對多數(shù)哺乳動物的毒性較大,制成兩性霉素B脂質(zhì)體,可使其毒性大大降低而不影響其抗真菌活性。1.3.5保護藥物提高穩(wěn)定性一些不穩(wěn)定的藥物被脂質(zhì)體包封后可受到脂質(zhì)體雙層膜的保護。如青霉素G或V的鉀鹽,為對酸不穩(wěn)定的抗生素,口服易被胃酸破壞,制成脂質(zhì)體則可受保護而提高穩(wěn)定性與口服的吸收效果。脂質(zhì)體存在的主要問題是,藥物易滲漏和磷脂材料因易氧化而不夠穩(wěn)定。1.4雙分子層基礎(chǔ)物質(zhì)脂質(zhì)體的膜材主要由磷脂與膽固醇構(gòu)成的類脂質(zhì)雙分子層。1.4.1磷脂類磷脂類包括卵磷脂、腦磷脂、大豆磷脂以及其他合成磷脂,如合成二棕櫚酰-DL-(磷脂酰膽堿、合成磷脂酰絲胺酸等都可作為脂質(zhì)體的雙分子層基礎(chǔ)物質(zhì)。曾采用蛋黃卵磷脂為原料,用氯仿為溶劑提取,即得卵磷脂,但產(chǎn)品中氯仿不易除盡,此外卵磷脂的成本要比豆磷脂高得多。豆磷脂的組成為卵磷脂與少量腦磷脂的混合物。磷脂可在體內(nèi)合成,還可相互轉(zhuǎn)化,如腦磷脂可轉(zhuǎn)化為卵磷脂和絲氨酸磷脂,絲氨酸磷脂也可轉(zhuǎn)化為腦磷脂。1.4.2膽固醇膽固醇具有調(diào)節(jié)膜流動性的作用,故可稱為脂質(zhì)體“流動性緩沖劑”(fluiditybuffer)當(dāng)?shù)陀谙嘧儨囟葧r,膽固醇可使膜減少有序排列,而增加流動性,高于相變溫度由可增加膜的有序排列而減少膜的流動性。1.5燒瓶式或多室脂質(zhì)體法脂質(zhì)體的制備方法很多,常用的有下列幾種:1.5.1注入法將磷脂與膽固醇等類脂質(zhì)及脂溶性藥物共溶于有機溶劑中(一般多采用乙醚),然后將此藥液經(jīng)注射器緩緩注入加熱至50℃(并用磁力攪拌)的磷酸鹽緩沖液(可含有水溶性藥物)中,加完后,不斷攪拌至乙醚除盡為止,即制得脂質(zhì)體,其粒徑較大,不適宜靜脈注射。再將脂質(zhì)體混懸液通過高壓乳勻機2次,則所得的成品,大多為單室脂質(zhì)體,少數(shù)為多室脂質(zhì)體,粒徑絕大多數(shù)在2μm以下。該法的優(yōu)點是類脂質(zhì)在乙醚或乙醇中的濃度不影響脂質(zhì)體的大小,缺點是使用有機溶劑和高溫,會使大分子物質(zhì)(如多肽、蛋白質(zhì)等)變性和對熱敏感的藥物失活。另外,脂質(zhì)體的粒度不均勻。如亞油酸脂質(zhì)體,取磷酸鹽緩沖液100ml,在磁力攪拌器上攪拌加熱至約60℃;再稱取1g精制大豆磷脂、1g膽固醇、1g亞油酸及2g脫水山梨醇單油酸酯溶于30ml乙醚中,然后滴注于上述60℃緩沖鹽溶液中,繼續(xù)攪拌,加適量緩沖鹽溶液至100ml即得。1.5.2薄膜分散法將磷脂、膽固醇等類脂質(zhì)及脂溶性藥物溶于氯仿(或其他有機溶劑)中,然后將氯仿溶液在玻璃瓶中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),使在燒瓶內(nèi)壁上形成薄膜;將水溶性藥物溶于磷酸鹽緩沖液中,加入燒瓶中不斷攪拌,即得多室脂質(zhì)體,粒徑1～5μm。欲制得更小的脂質(zhì)體,可采用機械法(如超聲波分散法、擠壓法等)或化學(xué)法(如表面活性劑處理)。如氟尿嘧啶脂質(zhì)體,系用磷脂(卵磷脂或腦磷脂)、膽固醇與磷酸二鯨蠟酯,其摩爾比為7:2:1或4.8:2.8:1配成氯仿溶液,真空蒸發(fā)除去氯仿,使在器壁上形成薄膜,加入等滲的緩沖液(pH6.0,0.01mol·L-1磷酸鹽),其中含氟脲嘧啶77mmol·L-1,類脂質(zhì)在緩沖液中的濃度為50～70mmol·L-1,加0.5mm直徑的玻璃珠數(shù)枚,攪拌2min,在25℃放置2h,使薄膜吸脹;再在25℃攪拌2h,得到脂質(zhì)體,粒徑為0.5～5.0μm。1.5.3超聲波分散法將水溶性藥物溶于磷酸鹽緩沖液,加入磷脂、膽固醇與脂溶性藥物共溶于有機溶劑的溶液,攪拌蒸發(fā)除去有機溶劑,殘液經(jīng)超聲波處理,然后分離出脂質(zhì)體,再混懸于磷酸鹽緩沖液中,制成脂質(zhì)體混懸型注射劑。凡經(jīng)超聲波分散的脂質(zhì)體混懸液,絕大部分為單室脂質(zhì)體。多室脂質(zhì)體只要經(jīng)超聲波進一步處理亦能得到相當(dāng)均勻的單室脂質(zhì)體。如肝素脂質(zhì)體的制備,取肝素30～50mg溶于pH7.2磷酸鹽緩沖液中,在氮氣流下加入到由磷脂26mg、膽固醇4.4mg、磷酸二鯨蠟脂3.11mg溶于5ml氯仿制成的溶液中,蒸發(fā)除去氯仿,殘液經(jīng)超聲分散,分離出脂質(zhì)體,重新混懸于磷酸鹽緩沖液中。肝素含量為9.1U·mg-1,在4℃能貯存1個月。本品具有明顯抗凝作用,可供口服或注射給藥,具緩釋作用。1.5.4逆相蒸發(fā)法系將磷脂等膜材溶于有機溶劑如氯仿、乙醚中,加入待包封藥物的水溶液(水溶液:有機溶劑=1:3～1:6)進行短時超聲,直到形成穩(wěn)定的W/O型乳狀液,然后減壓蒸發(fā)除去有機溶劑,達到膠態(tài)后,滴加緩沖液,旋轉(zhuǎn)使器壁上的凝膠脫落,在減壓下繼續(xù)蒸發(fā),制得水性混懸液,通過凝膠色譜法或超速離心法,除去未包入的藥物,即得大單室脂質(zhì)體。本法特點是包封率可高達60%左右,有的包封率大于超聲波分散法30倍,它適合于包封水溶性藥物及大分子生物活性物質(zhì)如各種抗生素、胰島素、免疫球蛋白、堿性磷脂酶、核酸等。如超氧化物歧化酶脂質(zhì)體,將卵磷脂100mg和膽固醇50mg溶于乙醚中,加入用4mmol·L-1磷酸鹽緩沖溶液(PBS)配成溶液,超聲處理2min(每處理0.5min間歇0.5min),立即在水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至呈現(xiàn)凝膠狀,旋渦振蕩使凝膠轉(zhuǎn)相,再繼續(xù)蒸發(fā)除盡乙醚,超速離心(35000rpm,30min)分離除去未包入的超氧化物歧化酶,沉淀用水洗2次,離心,得沉淀,用10mmol·L-1PBS稀釋,即得。1.5.5冷凍干燥法將磷脂經(jīng)超聲處理高度分散于緩沖鹽溶液中,加入凍干保護劑(如甘露醇、葡萄糖、海藻酸等)冷凍干燥后,再將干燥物分散到含藥物的緩沖鹽溶液或其他水性介質(zhì)中,即可形成脂質(zhì)體。此法適合包封對熱敏感的藥物。如維生素B12脂質(zhì)體,取卵磷脂2.5g分散于67mmol·L-1磷酸鹽緩沖液(pH7)與0.9%氯化鈉溶液(1:1)的混合液中,超聲處理后與甘露醇混合,于真空下冷凍干燥,隨即用含12.5mg維生素B12的上述緩沖鹽溶液進行分散,進一步超聲處理,即得均勻脂質(zhì)體混懸液。此外,制備脂質(zhì)體的方法還有復(fù)乳法、熔融法、表面活性劑處理法、離心法、前體脂質(zhì)體法和鈣融合法等,這里不再詳細介紹。1.6細胞房室內(nèi)應(yīng)用1.6.1脂質(zhì)體與細胞的相互作用脂質(zhì)體與細胞膜的組成相似,能顯著增強細胞攝取,延緩和克服耐藥性,脂質(zhì)體在體內(nèi)細胞水平上的作用機制有吸附、脂交換、內(nèi)吞、融合等。①吸附。吸附是脂質(zhì)體作用的開始,是普通物理吸附,受粒子大小、密度和表面電荷等因素影響。如脂質(zhì)體與細胞表面電荷相反,吸附作用大。②脂交換。脂質(zhì)體的脂類與細胞膜上脂類發(fā)生交換。其交換過程包括:脂質(zhì)體先被細胞吸附,然后在細胞表面蛋白的介導(dǎo)下,特異性交換脂類的極性基團或非特異性地交換?；湣＝粨Q僅發(fā)生在脂質(zhì)體雙分子層中外部單分子層和細胞質(zhì)膜外部的單分子層之間,而脂質(zhì)體內(nèi)藥物并未進入細胞。脂質(zhì)體可與血漿中各種組織細胞相互作用進行脂交換。④內(nèi)吞。內(nèi)吞作用是脂質(zhì)體的主要作用機制。脂質(zhì)體被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)細胞,特別是巨噬細胞作為外來異物吞噬,稱內(nèi)吞作用。通過內(nèi)吞,脂質(zhì)體能特異地將藥物濃集于起作用的細胞房室內(nèi),也可使不能通過漿膜的藥物達到溶酶體內(nèi)。⑤融合。融合指脂質(zhì)體的膜材與細胞膜的構(gòu)成物相似而融合進入細胞內(nèi),然后經(jīng)溶酶體消化釋放藥物。體外證明脂質(zhì)體可以將生物活性大分子如酶、DNA、環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、mRNA或毒素以細胞融合方式傳遞到培養(yǎng)細胞內(nèi)。因此對產(chǎn)生耐藥的菌株或癌細胞群,用脂質(zhì)體載藥可顯著提高抗菌或抗癌效果;大分子藥物被包封于脂質(zhì)體往往可以提高口服藥效;溶酶體膜的通透性有限,可阻止大分子藥物釋放至細胞內(nèi)其它部位,而脂質(zhì)體載大分子藥物由于融合作用則往往不受限制。1.6.2給藥途徑脂質(zhì)體在體內(nèi)可完全生物降解,一般無毒。脂質(zhì)體在體內(nèi)的作用受給藥途徑的影響。用不同方法可制備成各種大小和具有不同的表面性質(zhì)的脂質(zhì)體,因而可適用于多種給藥途徑。①靜脈注射。這是脂質(zhì)體常見的給藥途徑。脂質(zhì)體靜脈注射后迅速從血液循環(huán)中消除,其消除率與脂質(zhì)體大小及表面所帶電荷有關(guān)。大的脂質(zhì)體比小的消除快。近年來人們已注意到,脂質(zhì)體靜脈注射后被肝、脾、骨髓、血的巨噬細胞吸收可能產(chǎn)生毒性。②肌內(nèi)和皮下注射。脂質(zhì)體經(jīng)肌內(nèi)或皮下注射后,緩慢從注射部位消除,隨后吸收進入淋巴管,最后進入血液循環(huán)并廣泛分布于肝、脾的網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞中。根據(jù)淋巴管可以很快清除小于0.1μm微粒的機制,皮下注射多室脂質(zhì)體不易被淋巴結(jié)攝取,且從注射部位消除很慢,包封于脂質(zhì)體的藥物以恒定速率進入循環(huán)系統(tǒng)。而電中性及帶正電荷的小單室脂質(zhì)體易被局部淋巴結(jié)所攝取,通過淋巴管從注射部位進入全身循環(huán)。③經(jīng)皮給藥。脂質(zhì)體能夠使親脂性、難透過皮膚的大分子藥物以治療量透入皮膚并可維持恒定的釋放。也可使藥物滯留在表皮-真皮之間起局部效應(yīng),提高生物利用度,而無全身的副作用。④口服給藥。有些藥物以游離形式通過胃腸道時,不能被吸收或遭到破壞。但包封于脂質(zhì)體后即可通過胃腸道吸收。根據(jù)脂質(zhì)體緩釋和保護藥物的作用,可應(yīng)用脂質(zhì)體延長水溶性藥物的作用或用以包封胃腸道不吸收或不穩(wěn)定的藥物。⑤眼部給藥。脂質(zhì)體對外眼組織、結(jié)膜和鞏膜具有更強的親和力。滴眼后可迅速分散,增強藥物對角膜的穿透性。激素類藥物在眼部應(yīng)用時由于脂質(zhì)體的包封可減少循環(huán)系統(tǒng)的副作用。⑥鼻腔給藥。脂質(zhì)體經(jīng)鼻腔滴入給藥后很快轉(zhuǎn)移到支氣管處,如粒徑太大則給藥后沉積在無纖毛的鼻腔前部,影響吸收。賴氨匹林脂質(zhì)體平均粒徑為1.29μm,家兔20mg·kg-1連續(xù)鼻腔給藥20d,對鼻粘膜無損害,對健康受試者鼻腔給藥單劑量500mg,測得絕對生物利用度為93.8%。⑦肺部給藥。脂質(zhì)體靜脈注射后,只有少量分布到肺,因而不能在肺中達到治療的有效濃度,通常采用霧化