薏苡仁中氨基酸和蛋白質(zhì)類(lèi)成分的測(cè)定

薏苡仁中氨基酸和蛋白質(zhì)類(lèi)成分的測(cè)定

愛(ài)斯隆是水稻科的一種干燥成熟的種子。主要產(chǎn)于中國(guó)福建、河北、遼寧等地。這是傳統(tǒng)的中醫(yī)。它具有清熱除濕、健脾、除麻痹、清熱祛膿等功效。可用于水腫、排尿不良、氣滯、脾虛腹瀉、寒濕、收縮、肺蠕蟲(chóng)、腸蠕蟲(chóng)等的治療。現(xiàn)代研究表明,薏苡仁含有多種藥理活性的物質(zhì),如酯類(lèi)、不飽和脂肪酸類(lèi)、糖類(lèi)及內(nèi)酰胺類(lèi)等,具有抗腫瘤、抗氧化、降血糖的功能,且已有藥物已成功上市。蛋白作為生命結(jié)構(gòu)和功能的重要組成部分,因此具有重要研究?jī)r(jià)值,近幾十年來(lái)禾本科植物種子蛋白也獲得廣泛研究。種子儲(chǔ)藏蛋白根據(jù)其溶解特性可分為四大類(lèi):清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白。目前有大量關(guān)于小麥、大麥、玉米、高粱、水稻等重要作物種子儲(chǔ)藏蛋白研究,我國(guó)尚未有關(guān)于薏苡仁蛋白質(zhì)組成的詳細(xì)報(bào)道,本實(shí)驗(yàn)對(duì)薏苡仁蛋白質(zhì)組成、分子量大小做了較詳細(xì)研究,并對(duì)氨基酸組成進(jìn)行了分析。1材料和方法1.1其它試劑分析純薏苡仁購(gòu)自北京同仁堂藥店(產(chǎn)地福建,批號(hào)為20110702),經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)生藥系劉春生教授鑒定為禾本科植物薏苡的干燥果仁。其它試劑均為分析純。DHG-9053A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司),BP221S型電子分析天平(Sartorius公司),Neofuge23R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(HealForceDevelopmentLtd),SR-JX-4-13型高溫電阻爐(北京市永光明醫(yī)療儀器長(zhǎng)),WXG-4型旋光儀(上海申光儀器儀表有限公司)。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1b土壤蛋白、氨基酸總成分配比蛋白質(zhì)含量測(cè)定:薏苡仁研成粉末,并過(guò)40目篩?？偟鞍踪|(zhì)含量、醇溶蛋白和谷蛋白含量測(cè)定采用凱式定氮法,精密稱(chēng)定100mg固體或者5mL蛋白溶液于凱氏燒瓶中,然后依次加入濃硫酸(95%-98%)和催化劑并于熱源上消化,直至消化終點(diǎn)。將定容的消化液蒸餾,并用0.01M的稀鹽酸滴定。樣品中蛋白質(zhì)含量%=(A-B)×0.01×14×6.25×N/(C×1000)×100%A為滴定樣品用去的稀鹽酸平均體積(mL),B為滴定空白用去的稀鹽酸平均體積(mL),0.01為稀鹽酸的當(dāng)量濃度,14為氮的原子量,6.25為系數(shù),N為樣品的稀釋倍數(shù),C為稱(chēng)量樣品的重量(g)。清蛋白、球蛋白含量測(cè)定采用Brandford方法。旋光法進(jìn)行淀粉含量測(cè)定,烘干法進(jìn)行水分測(cè)定,馬弗爐法進(jìn)行灰分測(cè)定,索氏提取法進(jìn)行粗脂肪含量測(cè)定。1.2.2準(zhǔn)準(zhǔn)溶液及緩沖液制備蛋白、從蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白的活性鈉緩沖液采用順序抽提法進(jìn)行薏苡仁四大類(lèi)蛋白的提取。薏苡仁粉末經(jīng)石油醚脫脂,真空干燥,依次用雙蒸水、0.5MNaCl、70%乙醇(5%β-巰基乙醇,0.5%NaAc)、0.0125M硼酸鈉緩沖液(1%SDS,2%β-巰基乙醇)來(lái)抽提清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白。每組分震蕩抽提1小時(shí),離心9277rcf15min,收集上清液,沉淀用來(lái)提取下一組分。1.2.3上樣緩沖液和溴酚藍(lán)指示劑復(fù)配采用垂直板不連續(xù)體系:分離膠濃度15%,濃縮膠濃度5%。蛋白溶液加入上樣緩沖液后,100℃變性5min,上樣量20μg,恒壓電泳。當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑距膠底5mm時(shí),停止電泳?？捡R斯亮藍(lán)R-250染色。1.2.4水解真空水精密稱(chēng)定樣品粉末溶于6MHCl,110℃真空水解24h。水解產(chǎn)物真空干燥后溶于適量0.02MHCl,日立L-8900測(cè)定氨基酸含量。2結(jié)果2.1土壤中總蛋白和總灰總蛋白2.薏苡仁主要成分見(jiàn)表1:淀粉為70.84±0.49%,總蛋白含量為14.17±0.27%,而粗脂肪、灰分和水分的含量分別為3.83±0.32%、1.50±0.01%和10.68±0.11%。2.2薏養(yǎng)殖蛋白表達(dá)分析采用順序抽提法依次用雙蒸水、0.5MNaCl、70%乙醇(5%β-巰基乙醇,0.5%NaAc)和堿性溶液提取清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白,經(jīng)SDS電泳后,分離結(jié)果如圖1和圖2所示。清蛋白(圖1,3)電泳條帶較多,主要分布在70-10kD之間,且各蛋白間表達(dá)量無(wú)明顯差異。球蛋白(圖1,2)電泳條帶相對(duì)較少,主要分布在50-10kD之間,且蛋白表達(dá)量存在著明顯差異,在50、32、14和10kD左右存在著高豐度表達(dá)蛋白。醇溶蛋白按照分子量可分為4大類(lèi)即:α(19和22kD)、β(14kD),γ(16and27kD)和δ(10kD),在薏苡仁中表達(dá)量最高的是α-醇溶蛋白,其次是γ;而β和δ-醇溶蛋白表達(dá)量較低,條帶不明顯。谷蛋白條帶也較豐富,且存在著表達(dá)差異。對(duì)四大類(lèi)蛋白定量分析結(jié)果如表2所示,清蛋白含量為0.20±0.02mg/100mg(鮮重),占薏苡仁總蛋白的1.43%,含量最低;其次是球蛋白,占蛋白質(zhì)含量的6.20%。四類(lèi)蛋白中,含量最高的醇溶蛋白,其絕對(duì)含量和相對(duì)含量分別為6.34±0.07mg/100mg和44.74%;谷蛋白含量為37.38mg/100mg。因此,薏苡仁儲(chǔ)藏蛋白中以醇溶蛋白和谷蛋白為主,占總蛋白含量的82.22%。2.3leu和pro的測(cè)定采用酸水解法,進(jìn)行薏苡仁氨基酸含量測(cè)定,共檢測(cè)到15種氨基酸,其中含量最高的是Glu為3.59mg/100mg,其次是Leu和Pro分別為2.35mg/100mg和1.89mg/100mg。人體必需氨基酸和半必需氨基酸Thr、Val、Met、Ile、Leu、Phe、Lys、His和Arg的含量分別為0.42、1.23、0.17、0.54、2.35、0.46、0.24、0.30和0.44mg/100mg。3不同酸序列比對(duì)成品質(zhì)量的影響作為禾本科植物的重要成員之一,薏苡仁的起源、進(jìn)化、藥物價(jià)值的開(kāi)發(fā)始終是研究熱點(diǎn)之一。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的蓬勃發(fā)展,薏苡仁中蛋白結(jié)構(gòu)和功能的研究逐漸引起了人們的興趣。Zhou選取了薏苡仁22-KDα-醇溶蛋白基因家族位點(diǎn),進(jìn)行了比較基因組學(xué)研究,并提出了高粱、玉米和薏苡該基因家族的進(jìn)化模型,即三類(lèi)基因均經(jīng)歷了兩輪的基因擴(kuò)增:早期的局部基因復(fù)制和后期的快速基因擴(kuò)增。通過(guò)氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),甘蔗、玉米、高粱和薏苡仁醇溶蛋白氨基酸序列同源性在50%以上,有的可高達(dá)85%。根據(jù)溶劑不同將儲(chǔ)藏蛋白分為:清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白,其中后兩者所占比例較高。醇溶蛋白作為禾本科植物主要的儲(chǔ)藏成分,約占總蛋白量的50%左右,本實(shí)驗(yàn)中醇溶蛋白占總蛋白的44.74%,與Ottoboni報(bào)道的68.3%有一定的差異,其主要原因在于:(1)不同產(chǎn)地、不同品種、不同收獲季節(jié)的材料間蛋白含量存在著明顯的差異;(2)不同的提取方法導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異,本實(shí)驗(yàn)所用的提取液為70%乙醇(5%β-巰基乙醇),固液比1:10;而后者使用的抽提液為異丙醇(5%β-巰基乙醇),固液比為1:3;提取液和固液比的不同,導(dǎo)致了提取效率的差異。薏苡作為藥食兩用植物,在民間有著廣泛的應(yīng)用價(jià)值,因此,本研究對(duì)其氨基酸含量進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明,薏苡仁營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高,共檢測(cè)到Thr、Val、Met、Ile、P