hplc法測(cè)定鎖陽(yáng)中原兒茶酸的含量

hplc法測(cè)定鎖陽(yáng)中原兒茶酸的含量

鎖陽(yáng)又名不老藥、銹鐵棒、地毛球和羊圈拉。這是鎖陽(yáng)科植物鎖陽(yáng)的干燥土壤。具有益腎陽(yáng)、益血潤(rùn)腸排便的功效。臨床上主要用于腰膝酸軟、陽(yáng)虛、滑精、腸干渴等證候，療效準(zhǔn)確。鎖陽(yáng)中含有的原兒茶酸,具有增加冠脈流量、降低心肌耗氧量、體外抑制血小板聚集和抗菌的活性[3~5]。鎖陽(yáng)及其制劑中原兒茶酸的含量測(cè)定尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本文以原兒茶酸為對(duì)照品,建立了以高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定鎖陽(yáng)藥材中原兒茶酸含量的方法,結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好,可為控制該藥材和飲片的內(nèi)在質(zhì)量提供參考依據(jù)。1材料表面1.1高效液相色譜儀檢測(cè)d-20001100高效液相色譜儀,包括G1311A四元泵、G1315ADAD檢測(cè)器、1100化學(xué)工作站(美國(guó)Agilent公司);高效液相色譜儀,包括L-6000泵、L-4200H檢測(cè)器、D-2500數(shù)據(jù)處理機(jī)(日本日立公司);D2025型十萬(wàn)分之一電子天平(瑞士MettlerToledo公司);SB2200-T超聲波提取器(上海必能信超聲有限公司)。1.2測(cè)定試劑及儀器原兒茶酸對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào):809-200102);乙腈為色譜純,水為重蒸餾水,其余試劑均為分析純;鎖陽(yáng)藥材由甘肅省張掖市藥品檢驗(yàn)所毛曉春副主任藥師鑒定為CynomoriumsongaricumRupr.。2方法和結(jié)果2.1理論塔板數(shù)測(cè)定色譜柱:LichrosorbODSC18(250mm×4.6mm,5m);流動(dòng)相:乙腈-水-冰醋酸(10∶100∶0.1);檢測(cè)波長(zhǎng):259nm;流速:1.0mL·min-1;柱溫:室溫;進(jìn)樣量:10μL。理論塔板數(shù)按原兒茶酸峰計(jì)算約為6400。在此色譜條件下,原兒茶酸和前后色譜峰可達(dá)到基線分離,拖尾因子為1.06,峰形基本對(duì)稱,詳見(jiàn)圖1。2.2對(duì)照品貯備溶液精密稱定原兒茶酸對(duì)照品9.10mg,置50mL量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,超聲處理10min,放至室溫,作為對(duì)照品貯備溶液;精密吸取上述對(duì)照品貯備溶液5mL,置25mL量瓶中,用流動(dòng)相稀釋至刻度,超聲處理10min,放至室溫,作為對(duì)照品溶液(每1mL含原兒茶酸36.4μg)。2.3水浴濃縮提取液制備取樣品粉末(過(guò)3號(hào)篩)約1g,精密稱定,加水50mL回流提取2次每次1合并提取液水浴濃縮至約10加鹽酸調(diào)節(jié)pH值為3,置分液漏斗中,用乙醚輕輕振搖提取4次(25、25、25、20mL),合并提取液,低溫?fù)]干乙醚,殘?jiān)昧鲃?dòng)相洗至10mL量瓶中,用流動(dòng)相稀釋至刻度,超聲處理10min,放至室溫,備用。2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性回歸法考察對(duì)照品進(jìn)樣量與峰面積積分值精密吸取上述對(duì)照品貯備溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL(分別含原兒茶酸0.364、0.728、1.092、1.456、1.820mg),分別置于25mL量瓶中,加流動(dòng)相稀釋至刻度,超聲處理10min,放至室溫。精密吸取上述5種溶液各10μL,按上述色譜條件,分別進(jìn)樣,測(cè)定。以對(duì)照品進(jìn)樣量(X,μg)為橫坐標(biāo),峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,得回歸方程:Y=1064644.9X+2584.3(r=0.9999)。結(jié)果表明,原兒茶酸進(jìn)樣量在0.15~0.73μg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。2.5精密度測(cè)試精密吸取對(duì)照品溶液,在上述色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果,原兒茶酸峰面積的RSD=0.55%,表明本方法精密度良好。2.6份3.9的測(cè)定取同一批樣品(產(chǎn)地:內(nèi)蒙古阿右旗)6份,按“2.9”項(xiàng)下方法測(cè)定。結(jié)果,平均含量為0.24mg·g-1,RSD=0.29%,表明本方法重現(xiàn)性好。2.7h內(nèi)平均含量取“2.6”項(xiàng)下同批樣品在4、8、12、24、48h分別測(cè)定。結(jié)果,24h內(nèi)平均含量為0.23mg·g-1,RSD=0.38%;48h內(nèi)平均含量為0.23mg·g-1,RSD=0.56%,表明被測(cè)樣品在48h內(nèi)穩(wěn)定性良好。2.8對(duì)照品溶液的制備取已知含量的樣品(產(chǎn)地:內(nèi)蒙古阿右旗,含量:0.24mg·g-1),共6份,每2份為一組,各加入一定量的對(duì)照品溶液,按上述方法制備供試品溶液,按“2.9”項(xiàng)下方法測(cè)定,結(jié)果詳見(jiàn)表1。2.9鎖陽(yáng)藥材和飲片中原兒茶酸含量測(cè)定照供試品溶液制備法制備10批供試品溶液,分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液,經(jīng)0.45μm針筒過(guò)濾器過(guò)濾,精密吸取10μL進(jìn)樣,按外標(biāo)法計(jì)算,被測(cè)鎖陽(yáng)藥材和飲片中原兒茶酸的含量測(cè)定結(jié)果詳見(jiàn)表2。3樣品含量測(cè)定在進(jìn)行系統(tǒng)性試驗(yàn)時(shí)從檢測(cè)器收集到的信息可知原兒茶酸在222、259、293nm波長(zhǎng)處均有最大吸收,且在259nm波長(zhǎng)處的靈敏度較高,故確定259nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。在確定色譜分離條件時(shí),筆者曾對(duì)甲醇-水-冰醋酸、乙腈-水-冰醋酸等不同流動(dòng)相進(jìn)行多次選擇比較,最終確定本文的檢測(cè)條件,結(jié)果原兒茶酸能夠達(dá)到基線分離、峰形好、保留時(shí)間相對(duì)適中、分離度較好,與甲醇-水-冰醋酸作流動(dòng)相比較,柱壓明顯降低,其它成分無(wú)干擾。筆者曾將回流、超聲、冷浸3種提取方法進(jìn)行比較,結(jié)果回流方法可有效提取原兒茶酸,提取效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于超聲、冷浸提取法,故采用回流提取法。以甲醇-冰醋酸(100∶1)、30%乙醇-冰醋酸(100∶1)、50%乙醇-冰醋酸(100∶1)、0.1mol·L-1鹽酸溶液、水等作為回流提取溶劑;以乙醚、乙酸乙酯、乙酸乙酯-乙醇(5∶1)作為萃取溶劑;并將提取時(shí)間、提取體積作為影響因素,對(duì)提取方法進(jìn)行優(yōu)選試驗(yàn),最終確定本文采用水回流提取,以乙醚萃取,蒸干溶劑,加定量流動(dòng)相溶解后進(jìn)樣的方法進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果可有效分離出原兒茶酸,減少了部分非測(cè)定物質(zhì)的干擾。另外,對(duì)萃取次數(shù)的比較,選定萃取4次,結(jié)果表