第十六章 流式細胞術(shù)及其臨床應(yīng)用進展

本章主要學(xué)習(xí)內(nèi)容和要求主要學(xué)習(xí)內(nèi)容要求流式細胞術(shù)的細胞參量與熒光探針

流式細胞術(shù)常用的臨床檢測項目臨床疾病的流式細胞術(shù)分析掌握

第十六章流式細胞術(shù)及其臨床應(yīng)用進展

流式細胞術(shù)的原理

熟悉了解流式細胞術(shù)常用的臨床檢測項目返回上一頁下一頁第一節(jié)概述

一、細胞功能分析的重要性

(一）細胞組學(xué)的概念

細胞組學(xué)是在多個細胞組并存的細胞異質(zhì)群體中，應(yīng)用多參數(shù)細胞分析技術(shù)，獲得由細胞遺傳和外界環(huán)境影響的細胞分子表型的最精確、最大量的信息。（二）細胞組學(xué)的研究特點

細胞組學(xué)是在單細胞水平上進行分析，反映了細胞的真實狀態(tài)，避免因組織或細胞體系不同細胞之間存在的異質(zhì)性而造成研究結(jié)果的偏差。細胞組學(xué)的思路與傳統(tǒng)研究不同，傳統(tǒng)的研究策略主要立足于對各個基因功能的研究，然后再考察它們在細胞中的作用以及相互聯(lián)系，而細胞組學(xué)則集中于細胞中分子表型的分析。細胞組學(xué)是在單細胞水平上蛋白質(zhì)組和基因組研究的結(jié)合，闡明細胞(組)功能與蛋白質(zhì)組關(guān)系的科學(xué)。（三）流式細胞術(shù)是研究細胞（組學(xué)）功能的有力工具

FCM是研究細胞（組學(xué)）功能的有力工具，采用流式細胞儀對細胞懸液進行快速分析，通過對流動液體中排列成單列的細胞進行逐個檢測，得到該細胞的光散射和熒光指標(biāo)，分析出其體積、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、DNA、RNA、蛋白質(zhì)、抗原等物理及化學(xué)特征。

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二、流式細胞術(shù)的發(fā)展趨勢（一）從相對細胞計數(shù)到絕對細胞計數(shù)

艾滋病患者的血液中輔助/誘導(dǎo)T細胞（CD3+CD4+CD8﹣）＜200個/μl，而僅有HIV感染而未發(fā)病者的該細胞數(shù)則＞200個/μl。

（二）從相對定量到絕對定量分析

傳統(tǒng)多以平均熒光強度（MFI）或相對熒光強度（RFI）表示細胞抗原或受體表達含量。由于系統(tǒng)誤差及所用儀器的型號不同，以MFI或RFI表示缺乏可比性。定量流式細胞術(shù)（Quantitativeflowcytometry，QFCM）應(yīng)用定量抗體微球法和定量熒光素分子微球法可獲得每個細胞上的平均抗原分子數(shù)。（三）從單色到多色熒光分析

新的熒光色素分子的不斷發(fā)現(xiàn)，熒光標(biāo)記技術(shù)的進步和流式細胞儀的多激光激發(fā)等技術(shù)的進展，多色熒光分析得到迅速發(fā)展，三色、四色甚至五色或六色熒光分析對細胞亞群的識別、細胞功能評價等更為精確。上一頁下一頁返回第一節(jié)概述

二、流式細胞術(shù)的發(fā)展趨勢（四）從細胞膜成份到細胞內(nèi)成份分析近年來細胞內(nèi)成分檢測技術(shù)的不斷完善，細胞內(nèi)成分檢測已成為流式細胞分析的又一個熱點，通過細胞內(nèi)成分檢測技術(shù)與多色免疫熒光分析方法結(jié)合，可檢測不同細胞亞群合成的不同細胞因子。（五）液體中可溶性成分的流式細胞分析近年來發(fā)展起來的流式微球分析（cytometricbeadassay，CBA）技術(shù)，可分析液體中的可溶性成分。（六）流式分子表型分析流式分子表型分析（molecularphenotyping）是指用流式細胞技術(shù)檢測細胞中特異性核酸序列或特異性基因異常。上一頁下一頁返回第二節(jié)流式細胞術(shù)的原理

一、流式細胞儀的基本結(jié)構(gòu)與功能流式細胞儀主要由以下五部分構(gòu)成:(一）流動室及液流驅(qū)動系統(tǒng)（FlowCell或FlowChamber）流動室是流式細胞儀的核心部件，單細胞懸液在細胞流動室里被鞘流液包繞通過流動室內(nèi)的一定孔徑的孔,檢測區(qū)在該孔的中心，細胞在此與激光垂直相交，在鞘流液約束下細胞成單行排列依次通過激光檢測。流動室里的鞘液流是一種穩(wěn)定流動。控制鞘液流的裝置是在流體力學(xué)理論的指導(dǎo)下由一系列壓力系統(tǒng)、壓力感受器組成，只要調(diào)整好鞘液壓力和標(biāo)本管壓力,鞘液流包繞樣品流并使樣品流保持在液流的軸線方向，能夠保證每個細胞通過激光照射區(qū)的時間相等，從而使激光激發(fā)的熒光信息準(zhǔn)確無誤。流動室及液流驅(qū)動系統(tǒng)（FlowCell或FlowChamber）上一頁下一頁返回第二節(jié)流式細胞術(shù)的原理

激光光源及光束形成系統(tǒng)

（二）激光光源及光束形成系統(tǒng)常用的激光管是氬離子氣體激光管，它的發(fā)射光波長488ηm,此外可配備氦氖離子氣體激光管（波長633ηm）和/或紫外激光管。在激光光源和流動室之間有兩個圓柱形透鏡，將激光光源發(fā)出的橫截面為圓形的激光光束聚焦成橫截面較小的橢圓形激光光束使通過激光檢測區(qū)的細胞受照強度一致。流式細胞儀的主要測定信號熒光是由激發(fā)光激發(fā)的，熒光信號的強弱與激發(fā)光的強度和照射時間相關(guān)。

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熒光信號檢測系統(tǒng)應(yīng)用熒光標(biāo)記的單克隆抗體染色進行多色分析，熒光信號的強弱，反映了細胞抗原表達的含量。（三）光學(xué)系統(tǒng)

流式細胞儀的光學(xué)系統(tǒng)由若干組透鏡、小孔、濾光片組成，大致可分為流動室前和流動室后兩組。流動室前的光學(xué)系統(tǒng)由透鏡和小孔組成，透鏡和小孔（一般為2片透鏡、1個小孔）的主要作用是將激光光源發(fā)出的橫截面為圓形的激光光束聚焦成橫截面較小的橢圓形激光光束，使激光能量成正態(tài)分布，通過激光檢測區(qū)的細胞受照強度一致，最大限度地減少雜散光的干擾。流動室后的光學(xué)系統(tǒng)主要由多組濾光片組成，濾光片的主要作用是將不同波長的熒光信號送到不同的光電倍增管。上一頁下一頁返回第二節(jié)流式細胞術(shù)的原理

散射光信號監(jiān)測系統(tǒng)（四）信號檢測與存儲、顯示、分析系統(tǒng)細胞成單行排列依次通過激光檢測區(qū)時產(chǎn)生散射光和熒光信號,散射光分為前向角散射（FS）和側(cè)向角散射（SS）。前向角散射（FS）反映被測細胞的大小,它由正對著流動室的光電二極管裝置接收并轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?；?cè)向角散射或900散射（SS）反映被測細胞的細胞膜、細胞質(zhì)、核膜的折射率和細胞內(nèi)顆粒的性狀,它由一個光電倍增管(PMT)接收并轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘柎鎯υ诹魇郊毎麅x的計算機內(nèi)。上一頁下一頁返回第二節(jié)流式細胞術(shù)的原理

細胞分選系統(tǒng)(cellsortingsestem)

引自/uplo-adfiles/images(五)細胞分選系統(tǒng)

在細胞流動室上裝有超聲壓電晶體,通電后超聲壓電晶體發(fā)生高頻震動，可帶動細胞流動室高頻震動,使細胞流動室噴咀流出的液流束斷成一連串均勻的液滴,每秒鐘形成液滴上萬個。每個液滴中包含著一個樣品細胞,液滴中的細胞在形成液滴前已被測量,如符合預(yù)定要求則可被充電,在通過偏轉(zhuǎn)板的高壓靜電場時向左或向右偏轉(zhuǎn)被收集在指定容器中,不含細胞液滴或細胞不符合預(yù)定要求液滴不被充電亦不發(fā)生偏轉(zhuǎn)進入中間廢液收集器中,從而實現(xiàn)了分選。上一頁下一頁返回第二節(jié)流式細胞術(shù)的原理

二、常用熒光染料的激發(fā)光和發(fā)射光波長熒光素激發(fā)光波長（nm）發(fā)射光峰值（nm）FITC488525（綠）PE488575（橙紅）PI488630（橙紅）ECD488610（紅）CY5488675（深紅）PreCP488675（深紅）

各種熒光信號由各自的光電倍增管(PMT)接收并轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘柡蟠鎯υ诹魇郊毎麅x的計算機硬盤或軟盤內(nèi)。上一頁下一頁返回第二節(jié)流式細胞術(shù)的原理

三、流式細胞術(shù)的數(shù)據(jù)顯示

1．單參數(shù)數(shù)據(jù)顯示和分析

單參數(shù)直方圖圖中橫坐標(biāo)是FITC熒光信號相對強度值（對數(shù)），縱坐標(biāo)表示細胞數(shù);圖中已根據(jù)陰性對照設(shè)定適當(dāng)?shù)摹伴T”（直線門），儀器的計算機就會給出測定值（包括陽性細胞%和平均熒光強度）

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2.雙參數(shù)數(shù)據(jù)顯示和分析

三、流式細胞術(shù)的數(shù)據(jù)顯示

外周血白細胞散射光雙參數(shù)點圖正常人外周血白細胞的前向散射光（FS）和側(cè)向散射光（SS）組成的點陣圖，橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)均是線性的，圖中淋巴細胞、單核細胞、粒細胞很明顯地分為3群，可以很容易地圈“門”分析各亞群細胞的數(shù)據(jù)。

上一頁下一頁返回第二節(jié)流式細胞術(shù)的原理三、流式細胞術(shù)的數(shù)據(jù)顯示3．三參數(shù)數(shù)據(jù)顯示和分析

三色淋巴細胞亞群分析a,b:淋巴細胞經(jīng)CD4-FITC,CD8-PEandCD3-PC5標(biāo)記c:分光圖（prism）表示三個熒光數(shù)據(jù)關(guān)系,顯示8組數(shù)據(jù)CD3+CD4+Th細胞CD3+CD8+Ts細胞abcCD3+CD4+Th細胞CD3+CD8+Ts細胞上一頁下一頁返回第二節(jié)流式細胞術(shù)的原理四、流式細胞術(shù)分析的原理及流程

（一）細胞分析

流式細胞術(shù)可同時進行多參數(shù)測量，信息主要來自特異性熒光信號及非熒光散射信號。液流中央的單個細胞通過測量區(qū)時，受到激光照射會向立體角為2π的整個空間散射光線，散射光的強度及其空間分布與細胞的大小、形態(tài)、質(zhì)膜和細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。在流式細胞術(shù)測量中，常用兩種散射方向的散射光測量：前向角（即0°角）散射（FSC）與側(cè)向散射（SSC），又稱90°角散射。FSC與細胞的大小有關(guān)，SSC主要用來獲取有關(guān)細胞內(nèi)部精細結(jié)構(gòu)的顆粒度。熒光信號主要包括自發(fā)熒光：即不經(jīng)熒光染色細胞內(nèi)部的熒光分子經(jīng)光照射后所發(fā)出的熒光；特征熒光：經(jīng)特異熒光染色而發(fā)出的熒光。自發(fā)熒光信號為噪聲信號，細胞成分中如核黃素、細胞色素等的含量越高，自發(fā)熒光越強；培養(yǎng)細胞中死細胞越高，自發(fā)熒光越強；細胞樣品中所含亮細胞的比例越高，自發(fā)熒光越強。

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（二）細胞分選分選原理是把液滴形成的信號加在壓電晶體上使之產(chǎn)生機械振動，使液柱斷列成均勻的液滴，一部分液滴中包有細胞，如果其特征與被分選的細胞特征相符，則儀器在這個被選定的細胞形成液滴時就充以特定的電荷，而未被選定細胞形成的細胞液滴和不包含細胞的空白液滴不被充電。帶有電荷的液滴向下落入偏轉(zhuǎn)板的高壓靜電場時，按照所帶電荷符號向左或向右偏轉(zhuǎn)，落入指定的收集器內(nèi)，完成分類收集的目的。（三）流式細胞儀的主要技術(shù)指標(biāo)①分析速度，大型機可達每秒上萬個細胞；②熒光檢測靈敏度，測出單個細胞﹤600個熒光分子,兩個細胞間的熒光差＞5%即可區(qū)分；③（FSC）光檢測靈敏度，F(xiàn)SC反映被測細胞的大小,一般能夠測量到

0.2μm～０.5μm；④分辨率，通常用變異系數(shù)CV值來表示，能夠達到﹤2.0%；⑤分選速度，＞1000個/秒，分選細胞純度可達99%以上。

上一頁下一頁返回第三節(jié)流式細胞術(shù)的細胞參量與熒光探針一、測試DNA和RNA含量的熒光探針：碘化丙啶（PI）和溴化乙啶（EB）

大鼠肝細胞DNA含量分析上一頁下一頁返回第三節(jié)流式細胞術(shù)的細胞參量與熒光探針二、測試DNA堿基組成的熒光探針雙鏈DNA的堿基對結(jié)構(gòu)受到所組裝分子堿基組成的約束(A=T,G=C）,在各物種中，（A+T）對于（G+C）的比例是不同的。在人類細胞接近1，而在細菌中比例是不同。由于HO(Hoechst)特異地和AT堿基對結(jié)合，CA3(Chro-momycinA3)特異地和GC堿基對相結(jié)合，利用HO／CA3雙染可以分析DNA的堿基組成,區(qū)別不同種類的細菌。三、測試染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的熒光探針用酸變性或熱變性等方法使DNA部分變性。變性的部分由雙鏈變成單鏈。丫啶橙(Acridineorange,A0)標(biāo)記后，凡是已變性的單鏈核酸由發(fā)綠色熒光變?yōu)榘l(fā)紅色熒光，所以紅色熒光的強度說明染色質(zhì)變性的程度。由于細胞周期各時相中，染色質(zhì)的凝集程度不同，經(jīng)酸或熱處理后，變性程度也不同，染色質(zhì)越凝集，對酸和熱變性越敏感。用這種方法可區(qū)分出細胞周期各時相如G0、G1、S、G2和M期細胞。四、測試細胞總蛋白含量的熒光探針測定總蛋白含量能檢測一個細胞群體生長和代謝的狀態(tài)，也可以區(qū)別任何不同蛋白含量的細胞亞群，F(xiàn)ITC是檢測總蛋白最常用的熒光探針。它是酸性染料，以共價鍵方式結(jié)合到蛋白的帶有正電荷的基團上，以藍光激發(fā)后，發(fā)出明亮的綠色熒光。FITC不能穿過活細胞的膜，若丹明640能對活細胞的蛋白進行染色。上一頁下一頁返回第三節(jié)流式細胞術(shù)的細胞參量與熒光探針

五、抗體和其它分子的共價標(biāo)記熒光探針染料B-藻紅蛋白R-藻紅蛋白C-藻青蛋白別藻青蛋白R-藻青蛋白FITC四甲基若丹明X-RITC德州紅分子量近似值240000240000224000104000103000390444547625消光系數(shù)2410000196000016000007000007600008000079500084000吸收峰(nm)545565490545565620650555618495555582596發(fā)射峰(nm)575578650660634525582601615量子產(chǎn)額0.980.800.510.680.70.50.20.51上一頁下一頁返回第三節(jié)流式細胞術(shù)的細胞參量與熒光探針六、測試細胞活性的熒光探針兩類熒光探針判斷細胞的活性，一類是能透過活的細胞膜進入細胞的分子，如FDA（二醋酸酯熒光素）；另一類是不能透過活細胞膜進入細胞中，但能對固定的細胞、膜有缺損的細胞核進行染色的熒光探針，如PI或EB。七、測試DNA合成的熒光探針采用BrdU單克隆抗體免疫熒光技術(shù)檢測細胞DNA合成。

八、測試細胞膜電位的熒光探針，檢測膜電位比較常用的親脂性陽離子熒光染料為Cyanine（花青苷）和Rhodamine123（若丹明123）。九、測試細胞內(nèi)pH的熒光探針細胞內(nèi)pH、膜電位和細胞內(nèi)鈣都是細胞激活過程中重要的細胞參量。pH熒光探針很多，較常用的BCECF（

二羧乙基一5，6羧基熒光素）和6－COFDA（6-羧基二醋酸酯熒光素）。十、測試細胞內(nèi)鈣的熒光探針熒光染料主要有5種：Quin-2、Indo-1、Fura-2、Fluo-3和Rhod-2、它們都是鈣鰲合劑EGTA的衍生物，有較高的量子產(chǎn)額并對鈣有較高的特異性親合力。

十一、測試細胞膜的流動性或微粘度的熒光探針通過測量結(jié)合到膜雙分子層中的疏水熒光探針的熒光偏振度來研究。

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一、淋巴細胞亞群分析

淋巴細胞亞群分析可以通過相對計數(shù)、絕對計數(shù)與率的變化監(jiān)控。（一）檢測原理單克隆抗體特異與淋巴細胞表面的抗原結(jié)合，經(jīng)多色熒光染料標(biāo)記，即可以把各種不同功能的淋巴亞群區(qū)分開來（二）臨床意義1．CD3+CD3+T細胞增高見于某些自身免疫性疾病（如SLE）、重癥肌無力、慢性活動性肝炎等；CD3+T淋巴細胞數(shù)減低見于某些白血病、應(yīng)用免疫抑制劑、放療過程中、先天性細胞免疫缺陷、艾滋病等2．CD4+T細胞下降常見于某些病毒感染性疾病，如艾滋病、巨細胞病毒感染、嚴(yán)重創(chuàng)傷、全身麻醉、大手術(shù)、應(yīng)用免疫抑制劑（如環(huán)孢霉素A）等；而類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎活動期CD4+T細胞則升高。3．CD8+T細胞下降常見于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、干燥綜合征、重癥肌無力等；而傳染性單核細胞增多癥急性期、巨細胞病毒感染等，CD8+T細胞常升高。4．CD4+/CD8+細胞比值下降，常見于艾滋病、瘤型麻風(fēng)病、惡性腫瘤進行期和復(fù)發(fā)時；CD4+/CD8+細胞比值升高，見于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎活動期、多發(fā)性硬化癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合征、重癥肌無力及器官移植后排斥反應(yīng)等。上一頁下一頁返回第四節(jié)流式細胞術(shù)常用的臨床檢測項目

一、淋巴細胞亞群分析淋巴細胞亞群分析可以通過相對計數(shù)、絕對計數(shù)與率的變化監(jiān)控。（一）檢測原理單克隆抗體特異與淋巴細胞表面的抗原結(jié)合，經(jīng)多色熒光染料標(biāo)記，即可以把各種不同功能的淋巴亞群區(qū)分開來

CD3+CD4+Th細胞CD3+CD8+Ts細胞上一頁下一頁返回第四節(jié)流式細胞術(shù)常用的臨床檢測項目

一、淋巴細胞亞群分析

（二）臨床意義1．CD3+T細胞增高見于某些自身免疫性疾病如SLE、重癥肌無力、慢性活動性肝炎等；CD3+T淋巴細胞數(shù)減低見于某些白血病、應(yīng)用免疫抑制劑、放療過程中、先天性細胞免疫缺陷、艾滋病等2．CD4+T細胞下降常見于某些病毒感染性疾病，如艾滋病、巨細胞病毒感染、嚴(yán)重創(chuàng)傷、全身麻醉、大手術(shù)、應(yīng)用免疫抑制劑（如環(huán)孢霉素A）等；而類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎活動期CD4+T細胞則升高。3．CD8+T細胞下降常見于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、干燥綜合征、重癥肌無力等；而傳染性單核細胞增多癥急性期、巨細胞病毒感染等，CD8+T細胞常升高。4．CD4+/CD8+細胞比值下降，常見于艾滋病、瘤型麻風(fēng)病、惡性腫瘤進行期和復(fù)發(fā)時；CD4+/CD8+細胞比值升高，見于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎活動期、多發(fā)性硬化癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合征、重癥肌無力及器官移植后排斥反應(yīng)等。上一頁下一頁返回第四節(jié)流式細胞術(shù)常用的臨床檢測項目

二、細胞周期、細胞凋亡、DNA倍體分析腫瘤細胞的細胞周期、細胞凋亡、DNA倍體分析是流式技術(shù)在臨床的重要應(yīng)用，臨床上可對一些惡性腫瘤進行早期診斷、早期治療及跟蹤隨訪，可明顯改善一些腫瘤的治愈率和生存率。（一）檢測原理多發(fā)性骨髓瘤正常人骨髓細胞DNA分析上一頁下一頁返回第四節(jié)流式細胞術(shù)常用的臨床檢測項目

二、細胞周期、細胞凋亡、DNA倍體分析

腫瘤細胞的細胞周期、細胞凋亡、DNA倍體分析是流式技術(shù)在臨床的重要應(yīng)用，臨床上可對一些惡性腫瘤進行早期診斷、早期治療及跟蹤隨訪，可明顯改善一些腫瘤的治愈率和生存率。

1.發(fā)現(xiàn)癌前病變，協(xié)助腫瘤早期診斷

2.提示癌前病變的癌變發(fā)生率與細胞不典型增生程度的相關(guān)性

3.在腫瘤的診斷、預(yù)后判斷和治療中的作用

4.指導(dǎo)化療方案

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Anti–IFN–gCD69Activation37℃IncubationIntracellularStainLyse/FixAcqusitionPermeabilizelymphocyteerythrocytestimulusSurfaceStainWashcytokineWashWashproteinblocking第四節(jié)流式細胞術(shù)常用的臨床檢測項目三、細胞因子的檢測

cytokine是由免疫細胞或非免疫細胞合成和分泌的小分子多肽,在調(diào)節(jié)機體多種細胞的生長、分化和功能,調(diào)節(jié)正常與病理狀態(tài)下的免疫應(yīng)答過程中起著十分重要的作用。（一）檢測原理

上一頁下一頁返回第四節(jié)流式細胞術(shù)常用的臨床檢測項目三、細胞因子的檢測(二）臨床意義臨床最常見的檢測是Th1/Th2、Tc1/Tc2分析。根據(jù)活化TC分泌細胞因子的種類，可將CD4＋、CD8＋T細胞分為：

CD4＋細胞：Th1（CD4＋、IFNr＋）

Th2（CD4＋、IL-4＋）

Th0（CD4＋、IFNr+、IL-4＋）

CD8＋細胞：Tc1（CD8＋、IFNr＋）

Tc2（CD8＋、IL-4＋）

1.Th1細胞可介導(dǎo)細胞免疫、細胞毒性T細胞的生長與活化、巨噬細胞的活化，介導(dǎo)遲發(fā)型過敏反應(yīng)，介導(dǎo)器官移植免疫排斥反應(yīng)，其功能亢進可導(dǎo)致自身免疫病。2.Th2細胞可介導(dǎo)體液免疫，促進B細胞生長和分化過程。3.Th1/Th2細胞比值兩者平衡偏移多見于感染、自身免疫病、過敏、免疫缺陷及腫瘤惡化。4.Th1/Th2可用于分析疾病發(fā)生發(fā)展，為臨床調(diào)整Th1/Th2的細胞平衡提供科學(xué)的治療依據(jù)。上一頁下一頁返回缺鐵性貧血4.78%正常人網(wǎng)織紅細胞1.07%再障（AA)0.03%溶血性貧血（HA)29.33%計數(shù)精確低水平網(wǎng)織紅細胞檢測操作快速、簡便(二）臨床意義1.預(yù)測骨髓移植效果2.貧血診斷及鑒別診斷3.評價療效第四節(jié)流式細胞術(shù)常用的臨床檢測項目

四、網(wǎng)織紅細胞分析

網(wǎng)織紅細胞（reticulocyte）是介于晚幼紅細胞和成熟紅細胞之間尚未完全成熟的紅細胞。計數(shù)外周血中網(wǎng)織紅細胞數(shù)量,對于評價骨髓紅系造血及網(wǎng)織紅細胞從骨髓到外周血的轉(zhuǎn)送速率有重要意義。

（一）檢測原理

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五、血小板功能分析及血小板疾病診斷

通過血小板膜糖蛋白的檢測可以診斷先天性或獲得性血小板疾病

（一）檢測原理血小板膜上有豐富的糖蛋白受體，是血小板發(fā)揮其功能的物質(zhì)基礎(chǔ)，靜止期和活化期血小板的膜糖蛋白受體的種類、含量、結(jié)構(gòu)和功能顯著不同，用不同的抗血小板單克隆抗體可測定和分析血小板功能狀態(tài)。血小板膜糖蛋白復(fù)合物診斷血小板缺陷性疾病

CD41-CD61復(fù)合物：血小板無力癥

CD42a-CD42b復(fù)合物：巨大血小板癥血小板活化的相關(guān)檢查 血小板顆粒膜糖蛋白，如CD62，CD63

血小板膜糖蛋白活化表位，如PAC-1血小板減少性疾病 血小板自身抗體檢測 網(wǎng)織血小板的檢測血小板脫落微粒的檢測上一頁下一頁返回第四節(jié)流式細胞術(shù)常用的臨床檢測項目五、血小板功能分析及血小板疾病診斷（二）臨床意義1.評價血小板活化程度的應(yīng)用領(lǐng)域，包括：缺血性冠狀動脈疾病如心絞痛、心梗死、血管成形術(shù)、心肺旁路術(shù)等；缺血性腦血管病如腦梗塞、TIA、腦動脈硬化等；高血壓病、高脂蛋白血癥、高粘滯血癥等；抗血小板藥物機制研究與療效監(jiān)測等；糖尿病及惡性腫瘤等。2.血小板相關(guān)抗體抗血小板自身抗體包括原發(fā)性、藥物誘導(dǎo)產(chǎn)生、合并其它自身免疫性疾病如SLE能引起嚴(yán)重的血小板減少。大多數(shù)原發(fā)性(免疫性)血小板減少性紫癜病人血小板上和/或血清中有抗自身血小板的血小板相關(guān)抗體PAIgG、PAIgA、PAIgM。3．血小板無力癥血小板無力癥時血小板膜GPIIb/IIIa明顯減少，用血小板質(zhì)膜糖蛋白單克隆抗體CD41、CD61和流式細胞儀測定不僅可測出GPIIb/IIIa減少，CD42a、CD42b基本正?；蚱?，還可測出GPIIb/IIIa減少程度，分類血小板無力癥。4.巨大血小板綜合征（BSS）血小板巨大,CD42a減少，CD42b減少，CD61增加。上一頁下一頁返回第四節(jié)流式細胞術(shù)常用的臨床檢測項目

六、HLA-B27檢測（一）檢測原理檢測選用CD3/HLA-B27雙標(biāo)記抗體，圈定T淋巴細胞亞群，再分析其細胞表面是否表現(xiàn)HLA-B27組織抗原。

（二）臨床意義1.診斷強直性脊柱炎HLA-B27與許多脊柱關(guān)節(jié)病密切相關(guān)，其中最具代表性的是強直性脊柱炎。90%的強直性脊柱炎患者HLA-B27檢測陽性，而普通人群的陽性率只有4%-8%。

2.其它疾病HLA-B27還與Reiter綜合癥（陽性率70%-90%）、銀屑病性關(guān)節(jié)炎（陽性率50%-60%）、急性前葡萄膜炎（40%-50%）和潰瘍性結(jié)腸炎伴關(guān)節(jié)?。?%-10%）等許多嚴(yán)重危害人類健康的脊柱性關(guān)節(jié)病相關(guān)。

3.HLA-B27基因型陽性的個體，患遺傳性免疫疾病的機率，比一般人要高很多，以強直性脊柱炎為例，約為87倍。因此HLA-B27檢測可以有效幫助臨床鑒別診斷強直性脊柱炎等血清陰性骨關(guān)節(jié)疾病。

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七、流式細胞術(shù)在臨床細菌學(xué)中的應(yīng)用

可檢測病原菌、毒素和血清抗體,還可用于抗生素敏感性試驗,對抗生素后效應(yīng)、細菌耐藥的異質(zhì)性等進行分析。（一）病原菌、毒素和血清抗體的檢測1.熒光染料直接檢測細菌;2.免疫熒光檢測細菌;3.FCM-RFLP檢測細菌（二）FCM在抗生素敏感性試驗中的應(yīng)用

FCM與熒光染料的聯(lián)合運用可判斷細菌活力和功能狀態(tài),由于速度快,該方法已被建議用作臨床實驗室的常規(guī)藥敏試驗。（三）細菌耐藥的異質(zhì)性檢測

FCM能通過不同細菌亞群對抗生素的敏感性不同,直觀地表現(xiàn)細菌的異質(zhì)性,從而有助于診斷不同細菌亞群引起的混合感染,以便提供正確的治療方案。（四）流式細胞術(shù)在其他病原微生物檢測中的應(yīng)用1.抗真菌藥物的活性測定;2.衣原體、支原體的檢測

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八、流式細胞術(shù)病毒檢測（一）病毒抗原的檢測與定量1.利用單克隆抗體檢測不同時期的CMV抗原可診斷CMV感染

;2.肝炎病毒標(biāo)志物的定量及動態(tài)檢測;3.HSV1,HSV2和HHV8受染細胞內(nèi)HSV抗原的檢測;4.細胞內(nèi)p24、p17、nef、gp120、gp160/gp41表達的檢測;5．測定逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度;（二）病毒核酸的檢測與定量

檢測原理：原位雜交FCM技術(shù)可檢出外周血樣中少見的產(chǎn)病毒細胞,經(jīng)固定的懸液細胞,與標(biāo)記有地高辛11-脫氧三磷酸尿苷(11dUTP)的HIV-1基因探針雜交,然后與熒光標(biāo)記的抗地高辛抗體反應(yīng),最后對由此產(chǎn)生的熒光信號作FCM分析便可檢出受染細胞的HIV-RNA。

（三）病毒抗體檢測

利用吸附有病毒抗原的聚苯乙烯微球作為載體的病毒抗體FCM分析技術(shù)已廣泛應(yīng)用。利用不同大小的微球,分別包被特異性病毒抗原后,可同時檢測多種病毒抗體,如CMV和HSV抗體,或同時檢出HIV-1的抗p31、gp120、gp41抗體,并可定量。上一頁下一頁返回第五節(jié)臨床疾病的流式細胞術(shù)分析

一、流式細胞術(shù)在免疫生物學(xué)和免疫技術(shù)研究中的應(yīng)用（一）細胞表面標(biāo)記及抗原決定簇性質(zhì)的研究

1.血液系統(tǒng)細胞表面標(biāo)記

2.細胞群體及細胞表面標(biāo)記變化的檢測

3.細胞表面抗原決定簇性質(zhì)的研究

4.細胞表面標(biāo)記分子的定量分析（二）細胞抗原表達的研究

1.抗原表達與遺傳學(xué)基礎(chǔ)的研究

2.抗原表達同細胞周期的關(guān)系研究

3.細胞不同生長期抗原表達的觀察

4.細胞生長環(huán)境與抗原表達的研究

(三)免疫和腫瘤細胞測定及分選中的應(yīng)用

1．細胞周期中靜止細胞的分離

2．人外周血嗜堿細胞的分離

3．外周血變異紅細胞的鑒定

4．從母體循環(huán)中分離出胎兒細胞

5．檢測免疫功能測定上一頁下一頁返回第五節(jié)臨床疾病的流式細胞術(shù)分析

二、流式細胞術(shù)在臨床免疫學(xué)中的應(yīng)用（一）總體區(qū)分淋巴細胞亞群

1.T細胞表面標(biāo)志的檢測

:CD3+,CD4+,CD8+2.B細胞表面標(biāo)志的檢測

:CD19+,CD20+3.NK細胞表面標(biāo)志的檢測

:CD57+,CD56+,CD16+（二）區(qū)分功能性淋巴細胞亞群

1．T細胞亞群的功能區(qū)分

抑制性T細胞（Ts）的表面標(biāo)志

CD8+CD28-

細胞毒性T細胞（Tc）表面標(biāo)志

CD8+CD28+

輔助性T細胞（Th）表面標(biāo)志

CD4+CD29+

誘導(dǎo)性T細胞（Ti）的表面標(biāo)志

CD4+CD45RA+2．B細胞亞群的區(qū)分

B1亞群:CD5+CD19-;B2亞群:CD5+CD19+3．根據(jù)活化T淋巴細胞分泌細胞因子的種類

4．區(qū)分活化淋巴細胞亞群

活化總T:CD3+/HLA-DR+；靜止總T:為CD3+/HLA-DR-；活化CD4+:CD4+/HLA-DR+；活化CD8+:CD8+/HLA-DR+；活化誘導(dǎo)分子為

CD69+細胞；CD4＋細胞Th1（CD4＋、IFNr＋）

Th2（CD4＋、IL-4＋）

Th0（CD4＋、IFNr+、IL-4＋）CD8＋細胞Tc1（CD8＋、IFNr＋）

Tc2（CD8＋、IL-4＋）

Tc0（CD8＋、IFNr＋、IL-4＋）上一頁下一頁返回第五節(jié)臨床疾病的流式細胞術(shù)分析

二、流式細胞術(shù)在臨床免疫學(xué)中的應(yīng)用(三)FCM在臨床免疫性相關(guān)疾病及其免疫功能檢測的應(yīng)用

1．檢測I型變態(tài)反應(yīng)（過敏性哮喘）時的介導(dǎo)分子

2．檢測HLA抗原

HLA-B7/B-27;HLA-DR,HLA-DP,HLA-DQ3．細胞因子受體檢測

4．T細胞受體庫檢測

TCRγ／δ;TCRα／β;TCRν／β5．機體免疫功能監(jiān)測的應(yīng)用主要用于自身免疫性疾病、變態(tài)反應(yīng)性疾病、免疫缺陷性疾病、感染性疾病（病毒、細菌、寄生蟲感染）相關(guān)抗原、免疫治療、腫瘤免疫及移植免疫的監(jiān)測

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三、流式細胞術(shù)分析在血液系統(tǒng)疾病檢測的應(yīng)用（一）白血病和淋巴瘤免疫分型

1．白血病免疫分型診斷標(biāo)準(zhǔn)(EGIL)標(biāo)準(zhǔn)

（1）B淋巴細胞系白血病的分型

Pro-B-ALL(BI型):CD19+,或/和CD22+,或/和CD79a+CommonALL(BII型)：CD19+,或/和CD22+,或/和CD79a+,CD10+Pre-B-ALL(BIII型):CD19+,或/和CD22+,或/和CD79a+,CyIgM+

成熟-B-ALL(BIV型):CD19+,或/和CD22+,或/和CD79a+，

Kappa/Lambda+

(2)T淋巴細胞系白血病的分型

Pre-T-ALL(TI型)：CD3+,CD7+Pre-T-ALL(TII型)：CD3+,CD2+，CD5+,CD8+

皮質(zhì)-T-ALL(TIII型)：CD3+,CD1a+

成熟-T-ALL(TIV型)：CD3+,CD1a+,Anti-TCR＋α/β+或γ/δ＋上一頁下一頁返回第五節(jié)臨床疾病的流式細胞術(shù)分析

三、流式細胞術(shù)分析在血液系統(tǒng)疾病檢測的應(yīng)用（一）白血病和淋巴瘤免疫分型

1．白血病免疫分型診斷標(biāo)準(zhǔn)(EGIL)標(biāo)準(zhǔn)

(3)急性髓性白血病(AML)的分型亞型常表達抗原

M0CD11bCD13或CD33M1CD13CD15CD33CD34HLA-DRCD56CD19M2CD11bCD13CD15CD33CD34M3CD11bCD13CD15CD33CD34M4CD4CD11bCD13CD14CD15CD33CD34M5CD4CD11bCD13CD14CD15CD33CD34