考研科目,動物生物化學(xué) 第13章 DNA的生物合成-復(fù)制

第13章DNA的生物合成－復(fù)制DNABiosynthesis---Replication本章主要內(nèi)容一DNA的復(fù)制過程二DNA的損傷和修復(fù)重點：中心法則的內(nèi)容和DNA復(fù)制的過程。

難點：DNA復(fù)制的過程。

DNA是生物遺傳的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，生物機(jī)體的遺傳信息以密碼的形式編碼在DNA分子上，表現(xiàn)為特定的核苷酸排列順序，并通過DNA的復(fù)制由親代傳遞給子代。

在后代的生長發(fā)育過程中，遺傳信息自DNA轉(zhuǎn)錄給RNA，然后翻譯成特異的蛋白質(zhì)，以執(zhí)行各種生命功能，使后代表現(xiàn)出與親代相似的遺傳性狀。A以DNA為模板，合成相應(yīng)DNA分子的過程。B以DNA為模板，合成相應(yīng)RNA分子的過程。C以RNA為模板，合成相應(yīng)蛋白質(zhì)的過程。

中心法則揭示了遺傳信息的傳遞方向。1958年F.Crick提出中心法則Reversetranscription遺傳信息傳遞的中心法則

中心法則總結(jié)了生物體內(nèi)遺傳信息的流動規(guī)律，揭示遺傳的分子基礎(chǔ)，不僅使人們對細(xì)胞的生長、發(fā)育、遺傳、變異等生命現(xiàn)象有了更深刻的認(rèn)識，而且以這方面的理論和技術(shù)為基礎(chǔ)發(fā)展了基因工程，給人類的生產(chǎn)和生活帶來了深刻的革命。復(fù)制：親代DNA或RNA在一系列酶的作用下，生成與親代相同的子代DNA或

RNA的過程。轉(zhuǎn)錄：以DNA為模板，按照堿基配對原則將其所含的遺傳信息傳給RNA，形成一條與DNA鏈互補(bǔ)的RNA的過程。幾個重要概念翻譯：亦叫轉(zhuǎn)譯，以mRNA為模板，將

mRNA的密碼解讀成蛋白質(zhì)的AA

順序的過程。逆轉(zhuǎn)錄：以RNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，生成DNA的過程。一DNA的復(fù)制

(replication)復(fù)制親代DNA子代DNA

由親代DNA合成兩個相同的子代DNA的過程。1半保留復(fù)制

(semi-conservativereplication)2雙向復(fù)制

(bidirectionalreplication)3半不連續(xù)復(fù)制

(semi-discontinuousreplication)4其他復(fù)制類型復(fù)制的類型1DNA的半保留復(fù)制由親代DNA生成子代DNA時，每個新形成的子代DNA中，一條鏈來自親代DNA，而另一條鏈則是新合成的，這種復(fù)制方式叫半保留復(fù)制。（1）概念（2）半保留復(fù)制的實驗證據(jù)

1958年Meselson&stahl用同位素示蹤標(biāo)記加密度梯度離心技術(shù)，證明了DNA是采取半保留的方式進(jìn)行復(fù)制。

[15N]DNA[14N-15N]DNA[14N]DNA[14N-15N]DNA親代DNA分子第一代DNA分子第二代DNA分子

（3）半保留復(fù)制的意義

①

使親代DNA所含的信息以極高的準(zhǔn)確

度傳遞給子代DNA分子。

②

DNA通過復(fù)制和基因表達(dá)這兩種主要

功能，決定了生物的特性和類型并體

現(xiàn)了遺傳過程的相對保守性。2雙向復(fù)制（bidirectionalreplication）

DNA從起始點（origin）向兩個方向解鏈，形成兩個延伸方向相反的復(fù)制叉，稱為雙向復(fù)制。（1）雙向復(fù)制的概念DNA的雙向和單向復(fù)制復(fù)制叉起始點起始點起始點復(fù)制叉復(fù)制叉單向復(fù)制雙向復(fù)制A.環(huán)狀雙鏈DNA及復(fù)制起始點B.復(fù)制中的兩個復(fù)制叉C.復(fù)制接近終止點(termination,ter)oriterABC(2)原核生物DNA雙向復(fù)制環(huán)狀DNA的復(fù)制

ABC環(huán)狀

DNA復(fù)制時所形成的Q結(jié)構(gòu)起始點復(fù)制叉的推進(jìn)（3）真核生物的雙向復(fù)制

真核生物每個染色體有多個起始點，是多復(fù)制子的復(fù)制。

習(xí)慣上把兩個相鄰起始點之間的距離定為一個復(fù)制子(replicon)，復(fù)制子是獨立完成復(fù)制的功能單位。5’3’oriorioriori5’3’5’5’3’3’5’5’3’復(fù)制子3’（4）復(fù)制起始點、復(fù)制子與復(fù)制叉3復(fù)制的半不連續(xù)性

DNA雙螺旋的兩條鏈?zhǔn)欠雌叫械模呋疍NA合成的聚合酶只能沿著5′→3′方向進(jìn)行

。

在DNA復(fù)制時，一條鏈的合成方向和復(fù)制叉的前進(jìn)方向相同，可以連續(xù)復(fù)制，叫作前導(dǎo)鏈（leadingstrand）。

而另一條鏈的合成方向和復(fù)制叉的前進(jìn)方向正好相反，不能連續(xù)復(fù)制，只能分成幾個片段（岡崎片段）合成，稱之為滯后鏈（laggingstrand）。前導(dǎo)鏈連續(xù)復(fù)制而隨從鏈不連續(xù)復(fù)制，就是復(fù)制的半不連續(xù)復(fù)制。3

5

3

5

3′5′3′5′解鏈方向領(lǐng)頭鏈(leadingstrand)隨從鏈(laggingstrand)DNA的半不連續(xù)復(fù)制3′5′半不連續(xù)復(fù)制4其他的復(fù)制方式

（1）滾環(huán)復(fù)制（2）取代環(huán)復(fù)制（3）反轉(zhuǎn)錄合成DNA(1)滾環(huán)復(fù)制－＋3

-OH5

-P－＋5'

5

3

3

5

＋－＋5

5

5

3

3

3

3

5'＋－＋－－dNTPDNA-pol

γ

(2)D環(huán)復(fù)制(D-loopreplication)

線粒體DNA(mitochondrialDNA，mtDNA)的復(fù)制形式。

1970年Temin和Baltimore同時分別從勞氏肉瘤病毒和小白鼠白血病病毒等致病RNA病毒中分離出逆轉(zhuǎn)錄酶。

定義:以RNA為模板在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成DNA的過程稱為逆轉(zhuǎn)錄。（3）反轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄病毒細(xì)胞內(nèi)的逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象RNA模板逆轉(zhuǎn)錄酶DNA-RNA雜化雙鏈RNA酶單鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄酶雙鏈DNA

①

以RNA為模板合成DNA(cDNA）。反轉(zhuǎn)錄酶有三個作用

②

水解RNA模板：專一水解RNA-DNA雜交分子中的RNA，起5′

3′和3′

5′核酸外切酶的作用。

③

以新合成單鏈DNA為模板合成第二條DNA。逆轉(zhuǎn)錄酶發(fā)現(xiàn)的意義①逆轉(zhuǎn)錄酶和逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象，是分子生物學(xué)研究中的重大發(fā)現(xiàn)。

②至少在某些生物，RNA同樣兼有遺傳信息傳代與表達(dá)功能。③拓寬了病毒學(xué)研究的領(lǐng)域。

5與DNA復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì)（1）DNA聚合酶（2）引物酶（3）DNA連接酶（4）DNA復(fù)制起始的酶及蛋白（1）DNA聚合酶①以四種脫氧核糖核苷酸（dNTP）作底物。②反應(yīng)需要接受模板的指導(dǎo)，可以利用

DNA雙鏈作為模板，亦可以單鏈DNA

作為模板。N3

5

5

OOHPPP-O-CH2OH③反應(yīng)需要有游離的3’-羥基作為引物。PPi5′AGCTTCAGGATA

3′

|||||||||||3′TCGAAGTCCTAGCGAC5′

3

5

外切酶活性

5

3

外切酶活性?切除復(fù)制時合成的RNA引物。

能辨認(rèn)錯配的堿基對，并將其水解。④

外切酶活性3

5

3

5

解鏈方向3′5′3′3′5′先導(dǎo)鏈(leadingstrand)隨從鏈(laggingstrand)引物引物引物原核生物中的DNA聚合酶

①DNA聚合酶Ⅰ:單體多功能酶。

5′3′聚合酶功能。

3′5′外切酶活性（錯配堿基）。

5′3′外切酶活性（主要是對DNA損傷的修復(fù)，在DNA復(fù)制時RNA引物切除及其空隙的填補(bǔ)）。323個氨基酸小片段5

核酸外切酶活性大片段/Klenow

片段

604個氨基酸DNA聚合酶活性

5

核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶DNA-polⅠ②DNA聚合酶Ⅱ：多亞基酶，

5′3′聚合酶功能

3′5′外切酶活性，無5′3′外切酶活性。可能在修復(fù)紫外光引起的DNA損傷中起作用。③DNA聚合酶Ⅲ：是原核生物DNA復(fù)制的主要聚合酶，由10種亞基組成。具有5′3′DNA聚合酶活性；具有3′5′外切酶活性；沒有5′3′外切酶活性。

DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶ⅡDNA聚合酶Ⅲ

亞基數(shù)目單體酶多亞基酶多亞基酶

5′3′聚合活性+++3′5′外切活性+++5′3′外切活性+--對DNA損傷的修復(fù)；切除RNA引物修復(fù)紫外光引起的DNA損傷復(fù)制的主要聚合酶，提高復(fù)制的保真性大腸桿菌中三種DNA聚合酶（2）引發(fā)酶(primase)

DnaG基因編碼，由特異的RNA聚合酶合成的3′羥基的一段RNA（5－10個核苷酸），此酶為引發(fā)酶，。在復(fù)制起始時催化引物（primer）合成，提供3

-OH末端。3

5

3

5

解鏈方向3′5′3′3′5′先導(dǎo)鏈(leadingstrand)隨從鏈(laggingstrand)引物引物引物

①

DNA聚合酶校對復(fù)制中的錯誤核苷酸，導(dǎo)致在形成新的磷酸二酯鍵前檢測前一個堿基是否正確，決定了不能從頭合成。為何先合成RNA引物，然后切除？復(fù)制的復(fù)雜性，但保證了復(fù)制的忠實性。

②

先合成一個低忠實性的RNA標(biāo)記的DNA，當(dāng)DNA開始聚合以后在以5′到3′核酸外切酶的功能切除，以脫氧苷酸代替。③

DNA復(fù)制的忠實性ADNA聚合酶Ⅰ和Ⅲ的作用，嚴(yán)格遵守堿基配對規(guī)律。BDNA聚合酶Ⅰ的3′5′外切酶活性，錯配堿基的修正。CRNA引物的合成與切除。DDNA聚合酶的方向（5′3′）。E

修復(fù)作用。（3）DNA連接酶（DNAligase）

連接DNA鏈3′-OH末端和相鄰DNA鏈的5′-P末端，使二者生成磷酸二酯鍵，從而把兩段相鄰的DNA鏈連成完整的鏈。HO5’3’3’5’DNA連接酶NAD（ATP）NMN＋pi(ADP+pi)5’3’5’3’DNA連接酶的作用①

DNA連接酶在復(fù)制中起最后接合缺口的作用。②在DNA修復(fù)、重組及剪接中也起縫合缺口作用。③是基因工程的重要工具酶之一。（4）DNA復(fù)制起始的酶類及蛋白①

DnaA蛋白②

DnaB蛋白③

DnaC蛋白④

DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶⑤

單鏈DNA結(jié)合蛋白大腸桿菌的復(fù)制起點為oriC，是由245個堿基對組成，這些序列在大多數(shù)細(xì)菌中是高度保守的，關(guān)鍵序列是3個13bp序列和4個9bp序列。復(fù)制起始點（E.coli-oriC）

3個13bp序列GATCTNTTNTTT

4個9bp序列TTATCCACA5

3

5

3

DnaA蛋白的結(jié)合位點A的甲基化控制復(fù)制何時開始①

DnaA蛋白

DnaA蛋白是由相同亞基組成的四聚體。復(fù)制起始時，DnaA蛋白辨認(rèn)并結(jié)合E.coli上復(fù)制起始點oriC，促使oriC局部解鏈。②

DnaB蛋白解螺旋蛋白：作用于氫鍵，使DNA雙鏈

解開成為兩條單鏈。DnaB解鏈方向③

DnaC蛋白

DnaC蛋白的作用是將具有解鏈酶活性的DnaB蛋白運(yùn)送到復(fù)制模板，并協(xié)同DnaB蛋白的作用。DnaBDnaC解鏈方向DnaB、DnaCDnaG（引發(fā)酶）DnaA蛋白復(fù)合物

解鏈過程中，DNA分子會過度擰緊、打結(jié)、纏繞、連環(huán)等現(xiàn)象，出現(xiàn)正超螺旋。④DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶（DNAtopoisomerase）

DNA分子一邊解鏈，一邊復(fù)制，

DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶是能夠松解DNA超螺旋結(jié)構(gòu)的酶。

108

局部解鏈后DNA復(fù)制過程中正超螺旋的形成拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ使DNA的一條鏈斷裂和再連接，使DNA解鏈旋轉(zhuǎn)不致打結(jié)DNA變?yōu)樗沙跔顟B(tài)。反應(yīng)不需ATP。拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ有稱旋轉(zhuǎn)酶，DNA分子兩條鏈斷裂和再連接，引入負(fù)超螺旋狀態(tài)，反應(yīng)需要ATP

。

⑤單鏈DNA結(jié)合蛋白

（singlestrandedDNAbindingprotein，SSB）

由四個亞基組成，與DNA亞基的組成表現(xiàn)明顯的協(xié)同效應(yīng)。

在復(fù)制中維持模板處于單鏈狀態(tài)并保護(hù)單鏈的完整。

模板的DNA總要處于單鏈狀態(tài)，而DNA分子只要符合堿墓配對，又總會有形成雙鏈的傾向，以使分子達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)和免受胞內(nèi)廣泛存在的核酸酶降解。⑥

引發(fā)體的形成

DnaA

DnaB、DnaCDNA拓?fù)洚悩?gòu)酶引物酶SSB3

5

3

5

引物酶含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA復(fù)制起始區(qū)域的復(fù)合結(jié)構(gòu)稱為引發(fā)體。引發(fā)體沿模板鏈5’

3’方向移動，具有識別合成起始位點的功能，移動到一定位置上即可引發(fā)RNA引物的合成。

復(fù)制起始的過程1．DnaA蛋白辨認(rèn)結(jié)合oriC的重復(fù)序列，并與

DNA形成復(fù)合物，引起解鏈；2．DnaB在DnaC的輔助下結(jié)合于初步打開的雙

鏈，并用其解螺旋酶活性開鏈；3．拓?fù)涿竿ㄟ^切斷、旋轉(zhuǎn)和再連結(jié)的作用，實

現(xiàn)DNA超螺旋的轉(zhuǎn)型；4．SSB結(jié)合在已開鏈的DNA模板上，使DNA在

一定的范圍內(nèi)保持開鏈狀態(tài)。5．引物酶介入，形成的引發(fā)體，可按照模板的

配對序列，催化NTP的聚合，生成引物。起始的過程辨認(rèn)并結(jié)合起始位點打開雙螺旋防止復(fù)螺旋單鏈結(jié)合蛋白解鏈酶引物引物酶DnaA合成（5）復(fù)制的延伸半不連續(xù)復(fù)制和半保留復(fù)制。在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐個加入引物或延長中的子鏈上，其化學(xué)本質(zhì)是磷酸二酯鍵的不斷生成。

5'3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH3'3'DNA-pol①

復(fù)制延長的過程②

前導(dǎo)鏈連續(xù)復(fù)制

順著解鏈方向而生成的子鏈，復(fù)制是連續(xù)進(jìn)行的。③

隨從鏈不連續(xù)復(fù)制

隨從鏈的復(fù)制必須等待模板鏈解開至足夠長度，才能從5′→3′方向生成引物然后復(fù)制(形成岡崎片斷，不連續(xù)復(fù)制)。隨從鏈的合成隨從鏈

在同一個復(fù)制叉上，前導(dǎo)鏈的復(fù)制先于后隨鏈，但兩鏈均在DNApolⅢ催化下進(jìn)行。

隨從鏈的模板可折疊或環(huán)繞成環(huán)狀，與前導(dǎo)鏈正在延長的區(qū)域?qū)R，使領(lǐng)頭鏈和隨從鏈的延長點都處在DNApolⅢ催化位點上。復(fù)制延長簡圖蛋白Mr亞基數(shù)功能SSB756004結(jié)合單鏈DNADnaB蛋白(解螺旋酶)3000006DNA解螺旋,引物體成分引物酶(DnaG蛋白)600001RNA引物合成,引物體成分DNA聚合酶Ⅲ90000018~20新鏈延長DNA聚合酶I1030001除去引物,填充缺口DNA連接酶740001連接DNA旋轉(zhuǎn)酶(DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ)4000004超螺旋參與鏈的延伸階段的蛋白質(zhì)和酶（6）復(fù)制的終止

原核生物基因是環(huán)狀DNA，雙向復(fù)制的復(fù)制片段在復(fù)制的終止點(ter)處匯合。

復(fù)制的起始點和終止點剛好把環(huán)DNA分為兩個半圓，兩個方向各進(jìn)行180，同時在終止點匯合。

oriter

E.coli8232

ori

terSV40500（7）RNA引物的切除RNA引物由大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ5′3′外切酶活性完成，留下的空隙由該酶聚合活性填補(bǔ)。（8）岡崎片段的連接

修復(fù)的岡崎片斷由DNA連接酶封閉缺口，小片段連接成完整的子代鏈。最末端岡崎片斷的RNA引物切除后可求助于另半圈的DNA的DNA鏈向前延伸來填補(bǔ)。末端DNA序列是多次重復(fù)的富含T、G堿基的短序列。TTTTGGGGTTTTGGGG…真核生物染色體線性DNA分子末端的結(jié)構(gòu)。(9)端粒(telomere)功能:

穩(wěn)定染色體的末端結(jié)構(gòu)。

防止染色體間末端連接。補(bǔ)償RNA引物切除后造成的空缺。

線性DNA的末端復(fù)制的問題當(dāng)端粒長度下降到某一臨界值時，細(xì)胞終止分裂：衰老、死亡“多莉”的衰老

研究端粒丟失的速率，預(yù)測人類的壽命

研究推測端粒酶與腫瘤的關(guān)系端粒酶(telomerase)

含有RNA鏈的逆轉(zhuǎn)錄酶，能以RNA為模板合成DNA的端粒結(jié)構(gòu)。端粒酶的催化延長作用爬行模型DNA聚合酶復(fù)制子鏈進(jìn)一步加工以RNA的A、C為模板以DNA的A、C為模板

DNADamage(Mutation)

andRepair

1.DNA的損傷

2.損傷修復(fù)系統(tǒng)

二DNA損傷（突變）與修復(fù)1DNA的損傷（DNAdamage

）

個別脫氧核糖核苷酸殘基甚至片段在DNA的構(gòu)成、復(fù)制或表型功能上的異常變化，稱為DNA損傷。也稱為突變（Mutation）。（1）定義遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變而引起的遺傳信息改變，均可稱為突變。在復(fù)制過程中發(fā)生的DNA突變稱為DNA損傷(DNAdamage)。從分子水平來看，突變就是DNA分子上堿基的改變。

（2）引發(fā)損傷的因素

①

物理因素：指紫外線和各種輻射，如紫外線可引起DNA鏈上相鄰的兩個嘧啶堿基發(fā)生共價結(jié)合，生成嘧啶二聚體。

如TT，TC，CC等二聚體。這些嘧啶二聚體由于形成了共價鍵連接的環(huán)丁烷結(jié)構(gòu)，因而會引起復(fù)制障礙。

②化學(xué)因素：化工原料、化工產(chǎn)品和副產(chǎn)品，各種工業(yè)的排放物、農(nóng)藥、食品防腐劑或添加劑，以至汽車排放的廢氣。（3）突變的分子改變類型錯配(mismatch)缺失(deletion)插入(insertion)重排(rearrangement)框移(frame-shift)

DNA分子上的堿基錯配稱點突變(pointmutation)發(fā)生在同型堿基之間，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。

轉(zhuǎn)換發(fā)生在異型堿基之間，即嘌呤變嘧啶或嘧啶變嘌呤。

顛換①錯配鐮形紅細(xì)胞貧血病人Hb(HbS)β亞基N-val

·

his

·

leu

·

thr

·

pro·

val

·

glu

·

·

·

·

·

·

C肽鏈CACGTG基因正常成人Hb(HbA)β亞基N-val

·

his

·

leu

·

thr

·

pro·

glu

·

glu

·

·

·

·

·

·

C肽鏈CTCGAG基因②缺失、插入和框移缺失：一個堿基或一段核苷酸鏈從DNA大分子上消失。插入：原來沒有的一個堿基或一段核苷酸鏈插入到DNA大分子中間。

框移突變：三聯(lián)體密碼的閱讀方式改變，造成蛋白質(zhì)氨基酸排列順序發(fā)生改變。

缺失或插入都可導(dǎo)致框移突變。谷酪蛋絲5