不同侵染時間南方根結(jié)線蟲病的診斷

不同侵染時間南方根結(jié)線蟲病的診斷

以南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲、水生根結(jié)線蟲和北方根結(jié)線蟲為主要植物病原體的根結(jié)線蟲，危害多個作物的根系，帶來重大疾病，包括瓜、茄子和豆類。關(guān)于線蟲問題,多數(shù)研究集中在防治方面,近些年在抗性基因定位、克隆、品種分子選育等方面也有研究報道,但對根結(jié)線蟲侵染后根部組織結(jié)構(gòu)變化的研究較少,僅見少量有關(guān)巨型細胞的報道。如,爪哇根結(jié)線蟲(M.javanica)侵染豆科植物(Viciafaba)后正常細胞核多次分裂而胞質(zhì)不分裂,從而形成巨型細胞;巨型細胞過多消耗寄主營養(yǎng),影響植物體營養(yǎng)和水分的運輸;根結(jié)線蟲侵染鷹嘴豆(chickpea)后所產(chǎn)生的巨型細胞來源取決于取食位點細胞,位點不同,細胞來源可能不同,由此推斷巨型細胞可以來源于多種細胞;不同種的根結(jié)線蟲,侵染產(chǎn)生的巨型細胞數(shù)量不同,每個巨型細胞內(nèi)的細胞核數(shù)目不同,取食位點也不同;植物對根結(jié)線蟲的抗性表現(xiàn)在植物生長過程中對巨型細胞的解體形式,如南方根結(jié)線蟲侵染不同品種的煙草,產(chǎn)生的巨型細胞在不同品種中的解體形式不同,抗性品種中所產(chǎn)生的巨型細胞以空洞化的形式解體,以此枯竭根結(jié)線蟲的食物來源,最終導致根結(jié)線蟲饑餓死亡,由此認為巨型細胞空洞化具有積極意義,可能是寄主植物的一種抗性機制。但是,此時的巨型細胞畢竟已經(jīng)導致了植物過多營養(yǎng)的消耗以及營養(yǎng)和水分的運輸。因此,跟蹤觀察根結(jié)線蟲侵入寄主植物后不同時間內(nèi)巨型細胞的形成部位和來源分化、維管組織的病理學特征,對及時采取有效措施控制根結(jié)危害部位的擴展、進而控制生產(chǎn)中根結(jié)線蟲的危害有指導意義。本研究擬觀察南方根結(jié)線蟲侵染黃瓜(Cucumissativus)寄主后,隨侵染時間的延長,根部根結(jié)的病理結(jié)構(gòu)變化,以明確根部受害時間、部位及病理特征,為進一步探討根結(jié)線蟲的致病機理、確定防治時間、選擇或研制有效的防治藥劑提供參考。1材料和方法1.1幼蟲的采集和接種自來水洗帶有大量根結(jié)的寄主根系,去表面土后,1%(質(zhì)量分數(shù))的NaClO消毒4min,自來水沖洗3min,蒸餾水漂洗4次,剖取根上的卵塊置于30μm尼龍篩上,室溫孵化二齡幼蟲,每日收集幼蟲,4℃保存,取近5d內(nèi)收集的幼蟲接種。1.2微生物和線蟲花卉營養(yǎng)土(吉林省德惠市芳潔花土廠生產(chǎn))、沙子和黏土按3∶3∶0.5比例(體積比)混合,高壓滅菌鍋121℃、0.105MP大氣壓下濕熱滅菌40mim,以殺死其中的微生物和線蟲。將滅菌土裝入具有小格(上底4.5cm×4.5cm、下底3cm×3cm、高5cm)的培養(yǎng)盤內(nèi),裝2盤,每盤72棵。黃瓜種子(市售千秋四號)浸泡發(fā)芽后,分別埋入方格中,每格種子1粒。28℃、14h和20℃、10h光照培養(yǎng)箱培養(yǎng),每2d淋或澆1次水。長出第1片真葉時(約6d)在其中一盤內(nèi)每孔接種根結(jié)線蟲約150條,作為處理,未接種根結(jié)線蟲的一盤作為對照。接種后每2d取樣觀察1次,記錄黃瓜根系根結(jié)數(shù)量、大小,并進行染色、切片觀察。1.3紅法染色觀察分別取接種苗及對照苗6株,次氯酸鈉-酸性品紅法染色觀察,酸性甘油(加若干滴5mol/LHCl)保存,于OlympusBX51光學顯微鏡下觀察根結(jié)的形成及其部位,并拍照。1.4faa染色及轉(zhuǎn)染南方根結(jié)線蟲在19.5℃下生活周期為44d,30℃條件下生活周期20d。本試驗黃瓜幼苗培養(yǎng)溫度為20～28℃,觀察至第30天根表面見到卵塊止(根結(jié)線蟲1個生活周期)。從接種后第3天開始,每2d取接種及對照幼苗各3株切片染色。第1次取初發(fā)現(xiàn)的根結(jié),之后每次取根系上較大的根結(jié),對照苗取根系對應(yīng)部位。FAA固定24h后每隔1h依次用體積分數(shù)分別為70%、80%、90%、95%、100%的酒精脫水,其中100%酒精脫2次;二甲苯透明后60℃浸蠟包埋;旋轉(zhuǎn)切片機橫、縱切片,厚度10μm;動物膠粘片于載玻片上,40℃烘干,番紅-固綠對染,加拿大樹膠封固,OlympusBX51光學顯微鏡下觀察并拍照。2結(jié)果與分析2.1苗木生長正常,苗木直徑經(jīng)濟,黃瓜幼苗接種根結(jié)線蟲后,在觀察周期內(nèi),根結(jié)數(shù)量及根結(jié)最大直徑變化隨接種天數(shù)的增加而增加(圖1)。接種后6d,在接種苗的各級側(cè)根根尖部位開始見有根結(jié)(圖2(c)),直徑最大可達0.5mm,而對照根相應(yīng)部位只有0.1mm;接種后10d,對照根系生長正常,主根明顯,下胚軸筆直,苗根的相應(yīng)部位只有0.2mm(圖2(a)),而接種苗主根不明顯,下胚軸彎曲。根尖部位及遠離根尖的部位均有明顯根結(jié)(rk),既有對稱的又有偏于一側(cè)的,部分根結(jié)成串存在(圖2(b)),直徑最大可達1.1mm;16d時接種苗根結(jié)數(shù)量明顯增多,直至第30天時平均每株幼苗根結(jié)數(shù)增加到54.5個,根結(jié)直徑最大可達2.8mm(圖1),而對照根無根結(jié),相應(yīng)部位只有0.4mm。2.2齡根結(jié)線蟲的分離和鑒定本實驗觀察到根結(jié)出現(xiàn)的第一時間在接種后第6d,根尖部位整體透明NaClO-酸性品紅染色后,觀察到紅色膨大、對稱的根結(jié),最初出現(xiàn)部位主要在各級側(cè)根尖端的分生區(qū)及伸長區(qū)(圖2(c));接種后8d,通過NaClO-酸性品紅染色,在伸長區(qū)之上的根毛區(qū)及更上方可見侵入根內(nèi)的二齡根結(jié)線蟲(圖2(f));接種后10d,根系整體觀察,根結(jié)線蟲侵染的幼苗主根不明顯,下胚軸彎曲,根結(jié)明顯,有的連接成串,可見既有對稱又有偏于一側(cè)的根結(jié)(圖2(b))。2.3差生木質(zhì)部prx導管的轉(zhuǎn)分化分別取接種后6d(第一時間出現(xiàn)根結(jié))至30d(根結(jié)中出現(xiàn)卵塊)的接種苗根結(jié)部位與對照苗根的相應(yīng)部位做石蠟橫、縱切片觀察。接種根結(jié)線蟲6d時的黃瓜幼苗根尖縱切顯示根結(jié)在分生區(qū)、伸長區(qū)形成,二齡幼蟲已經(jīng)侵入根中,建立了取食位點并形成了巨型細胞(gc)(圖2(d)),在相應(yīng)部位的根結(jié)橫切面上,可見根中央出現(xiàn)的具有多核、細胞質(zhì)濃厚的5個巨型細胞,周圍沒有維管組織分化(圖2(e))。隨著侵染時間的延長至第8天時,根結(jié)可成串存在,且巨型細胞的數(shù)目也隨之增多。隨著根的伸長生長及組織的分化,10d時根結(jié)橫切面可見在巨型細胞占據(jù)的后生木質(zhì)部周圍有3束(三原型)原生木質(zhì)部(prx)導管(圖2(g)),此時對照橫切顯示的是三原型初生木質(zhì)部(px)導管和與木質(zhì)部相間排列的初生韌皮部(pp)(圖2(i))。由此分析認為,根結(jié)內(nèi)的巨型細胞可能是由原形成層細胞中本應(yīng)分化為后生木質(zhì)部導管的細胞轉(zhuǎn)分化形成,巨型細胞所在的相應(yīng)部位應(yīng)該是后生木質(zhì)部的位置。接種后10d的根結(jié)縱切顯示,根中央的巨型細胞隔斷了后生木質(zhì)部上下相通的導管(ve)(圖2(h)),而對照縱切面圖2(j)中可看到根中央的木質(zhì)部導管(ve)上下貫通。接種后12d時,有的根結(jié)在已經(jīng)形成了初生維管組織的部位產(chǎn)生,橫切可見巨型細胞(gc)位于初生木質(zhì)部的外側(cè)(圖2(k)),說明巨型細胞是由維管組織外圍的薄壁細胞分化形成。接種后16d,根結(jié)橫切面顯示,無論在根中央(圖2(l))或偏于一側(cè)(圖2(m))的巨型細胞均已有次生木質(zhì)部(sx)導管形成,而同期對照根中仍為初生維管組織,說明巨型細胞導致寄主根提早分化產(chǎn)生次生維管組織。接種后20d,對照橫切圖2(n)顯示,三原型的初生木質(zhì)部(px)之間僅有少量次生木質(zhì)部(sx)導管形成,維管組織排列有序,而同時期的根結(jié)內(nèi)已存在有大量次生木質(zhì)部的導管,根的中柱過度膨大,皮層相對變薄,根的橫切面直徑明顯增大,巨型細胞數(shù)量增多、體積增大,更多的維管組織外圍細胞大量分化,形成新的維管組織(nvt)(圖2(o))。說明巨型細胞數(shù)量的增加刺激維管組織外圍細胞大量分化,在皮層中形成新的維管組織。接種后24d,圖2(p)根結(jié)縱切顯示導管分子排列完全扭曲,維管組織上下迂回連通。接種后30d,根結(jié)橫切顯示(圖2(q))有些巨型細胞內(nèi)營養(yǎng)被根結(jié)線蟲吸收,細胞出現(xiàn)空洞(vagc),維管組織雖然多,但排列處于混亂無序狀態(tài)。3討論3.1根結(jié)線蟲感染的病理特征及主要癥狀的分析3.1.1型細胞的形成已有研究結(jié)果表明,根結(jié)線蟲侵染寄主形成根結(jié)的過程主要是通過二齡幼蟲從根系近根冠部位侵入,穿過生長錐向伸長區(qū)移動,尋找適宜的侵入位點細胞,同時食道腺分泌物質(zhì),刺激線蟲頭部圍繞的寄主細胞形成5～7個巨型細胞,由此形成根結(jié)。本研究病理組織切片表明,根結(jié)線蟲的侵入不僅導致巨型細胞產(chǎn)生、隨之出現(xiàn)根結(jié)圖2(c),圖2(e),還使次生維管組織提早形成圖2(l),圖2(m),使皮層中逐漸出現(xiàn)新的維管組織圖2(o),因此,寄主被侵染16d以后較膨大的根結(jié)(直徑1.3～1.5mm)是由巨型細胞、次生維管組織、皮層中新維管組織共同形成。3.1.2根結(jié)線蟲核心細胞的染正本研究發(fā)現(xiàn)根結(jié)有與根系中心對稱圖2(b)、圖2(l)和偏于寄主根系一側(cè)圖2(b)、圖2(m)2種類型。本研究認為其與根結(jié)線蟲侵染位置和巨型細胞來源有關(guān):當根結(jié)線蟲侵染根尖分生區(qū)、伸長區(qū)部位時,巨型細胞在伸長區(qū)來源于原形成層細胞,伸長區(qū)細胞發(fā)育至成熟區(qū)時,則巨型細胞來源于本應(yīng)分化為后生木質(zhì)部導管的細胞,此種情況下的巨型細胞出現(xiàn)在寄主根系中央,根結(jié)與根系中心對稱;當根結(jié)線蟲侵染寄主根系的成熟區(qū)或以上部位時,巨型細胞由維管柱外側(cè)韌皮薄壁細胞、中柱鞘及皮層細胞分化而來,出現(xiàn)在根的維管柱一側(cè),根結(jié)偏于根系中心一側(cè)。3.1.3型鋼細胞空洞化的作用機制本研究發(fā)現(xiàn)接種后30d時,可見巨型細胞中營養(yǎng)被侵入的根結(jié)線蟲耗盡,細胞出現(xiàn)空洞圖2(m),圖2(q),表現(xiàn)出細胞衰老,被侵染植株根系已經(jīng)異常,地上部分生長也已經(jīng)受到影響乃至枯萎死亡。有研究認為巨型細胞空洞化是寄主植物的一種抗性機制,因為作為根結(jié)線蟲唯一生活來源的巨型細胞一旦空洞,根結(jié)線蟲因?qū)⑹ヰB(yǎng)料來源而死亡。本研究認為,巨型細胞空洞化對寄主植物是否有積極意義主要決定于空洞化出現(xiàn)的時間。如果在根結(jié)線蟲侵入的早期時間約10d以前,幼蟲尚未發(fā)育為成蟲,細胞空洞后,線蟲死亡,根系次生維管組織產(chǎn)生,彌補巨型細胞阻斷的后生木質(zhì)部形成、薄壁細胞分化和阻隔的導管上下貫通,植株可以繼續(xù)發(fā)育,巨型細胞空洞化對寄主植物具有積極意義。如果根結(jié)線蟲侵入時間過長(約30d以后),線蟲已經(jīng)發(fā)育為孕卵的成蟲,并已經(jīng)開始產(chǎn)卵,此時空洞的巨型細胞雖然最終能使其死亡,但線蟲的卵已經(jīng)產(chǎn)出,寄主根系已經(jīng)由上百條根結(jié)線蟲在幾十個根結(jié)內(nèi)、造成了上千個巨型細胞空洞(每條線蟲造成5～7個巨型細胞),即使寄主是抗性品種,能否耐受如此損傷有待觀察。3.1.4立地條件對分布的影響傳統(tǒng)的植物病理學認為,根結(jié)線蟲的致病機理是通過吸收巨型細胞中的營養(yǎng)而消耗寄主營養(yǎng),導致寄主受害,嚴重時枯萎死亡。本研究的病理組織切片表明,根結(jié)線蟲侵染寄主16d后,巨型細胞、提早形成的次生維管組織圖2(l),圖2(m)、皮層中的新維管組織圖2(o)共同消耗寄主植物營養(yǎng),直至枯竭,從而影響植株的正常生長發(fā)育,乃至枯萎死亡。除此之外,本研究認為多種細胞分化而來的巨型細胞不僅影響根中多種細胞組織的正常分化和組織器官的形成圖2(g),圖2(k);而且還隔斷正常維管組織的排列,迫使導管迂回連接或在皮層中形成圖2(h),圖2(p),從而嚴重影響寄主根系的正常吸收與運輸。3.2根結(jié)線蟲的免疫根結(jié)線蟲接觸到寄主植物并侵入到根內(nèi)需要12～24h,之后可在1～2d內(nèi)形成根結(jié),本研究第一時間發(fā)現(xiàn)根結(jié)的時間是在接種后6d,說明根結(jié)線蟲在根際土壤環(huán)境中需要1～2天的時間接觸到寄主。有研究表明,盡管抗性品種,根結(jié)線蟲的侵入也會使寄主根系出現(xiàn)膨大的根結(jié),組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)巨型細胞,且不同抗性品種根內(nèi)的巨型細胞數(shù)量及形成并無明顯差異,即植物對根結(jié)線蟲的抗性并不