人參白虎湯對糖尿病大鼠血管舒縮活性改變的保護(hù)作用

人參白虎湯對糖尿病大鼠血管舒縮活性改變的保護(hù)作用

糖尿病已成為影響大眾健康的嚴(yán)重慢性疾病。誘發(fā)的血管并發(fā)癥,更是被人們廣泛重視。其中糖尿病大血管病變,如主動脈粥樣硬化,糖尿病心肌病、腦血管病易于發(fā)生,且呈多部位性,以嚴(yán)重動脈粥樣硬化為特點(diǎn),是糖尿病致死致殘的重要原因。大量實(shí)驗(yàn)證明,糖尿病時(shí)主動脈膠原及彈性蛋白的非酶糖基化產(chǎn)物增加,彈性下降,舒張作用減弱,血管痙攣。但對收縮及舒張功能變化特點(diǎn)及機(jī)制尚不完全清楚,所以本實(shí)驗(yàn)通過觀察鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠胸主動脈環(huán)對Phe、Ach反應(yīng)張力及在L-Arg、NLA及Ind溫孵后反應(yīng)張力改變的情況,進(jìn)一步認(rèn)識糖尿病主動脈收縮及NO,PGI2及EDHF等引起舒張的變化特點(diǎn)。人參白虎湯源于《傷寒論》,為中藥臨床治療消渴證(現(xiàn)代醫(yī)學(xué)之糖尿病)的著名方劑。為進(jìn)一步研究和開發(fā)此方,我們就其活性部位進(jìn)行了篩選,得到復(fù)合活性部位RB,并觀察了其對糖尿病大鼠主動脈環(huán)舒張及收縮功能改善情況。1試劑與儀器1.1動物SD雄性大鼠,180～220g,購于南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。1.2受試藥物人參白虎湯復(fù)合活性部位(RB):由人參、知母總多糖和總皂苷組成。根據(jù)人參、知母在原方中的配伍比例(1∶2)以及人參、知母總多糖和總皂苷提取得率將4種成分混合配伍,得到復(fù)合活性部位的受試藥。1.3陽性對照藥格列本脲(Gly):汕頭金石制藥總廠(批號:020606)。1.4試劑鏈脲佐菌素(STZ)、去甲腎上腺素(NE)、苯腎上腺素(Phe)、吲哚美辛(Ind)、L-硝基精氨酸(NLA)、L-精氨酸(L-Arg)均為Sigma公司產(chǎn)品,乙酰膽堿(Ach)為上海三愛思有限公司產(chǎn)品,其他試劑均為市售國產(chǎn)分析純。1.5溶液0.1mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液,pH4.5。K-H液(mmol/L):NaCl119,NaHCO325,KCl4.6,KH2PO41.2,MgCl21.2,CaCl22.5,葡萄糖11。Phe梯度終濃度(mol/L)1×10-9,3×10-9,1×10-8,3×10-8,1×10-7,3×10-7,1×10-6,3×10-6,1×10-5。Ach梯度終濃度(mol/L)1×10-9,1×10-8,1×10-7,1×10-6,1×10-5。去甲腎上腺素(NE),吲哚美辛(Ind),L-硝基精氨酸(NLA),L-精氨酸(L-Arg)終濃度為1×10-5mol/L。所有溶液均用蒸餾水新鮮配制。pH值7.2～7.4。1.6儀器超級恒溫水浴(501型,上海實(shí)驗(yàn)儀器廠);微機(jī)化生理藥理實(shí)驗(yàn)教學(xué)系統(tǒng)軟件(江蘇生物醫(yī)藥工程學(xué)會電子技術(shù)研究所);JZ100,101型肌肉張力換能器(高碑店市新航機(jī)電設(shè)備有限公司)。2方法2.1大鼠分組及模型建立大鼠禁食12h后,腹腔注射STZ(溶解于0.1mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中,pH4.5)60mg/kg,兩周后測空腹血糖(FSG),FSG(16.7mmol/ml作為糖尿病大鼠。正常對照組大鼠腹腔注射同體積0.1mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。造模成功大鼠隨機(jī)分為4組:模型組、RB高劑量組(100mg/kg·d-1,ig)、RB低劑量組(50mg/kg·d-1,ig)、格列本脲組(10mg/kg·d-1,ig),并設(shè)正常對照組。共給藥75d。2.2u3000酸、堿分別滴定、干燥給藥75d后,戊巴比妥鈉(40mg/kg,ip)麻醉解剖迅速取出胸主動脈,置于4℃K-H液中持續(xù)通100%O2,仔細(xì)分離周圍組織,剪成3mm左右主動脈環(huán)固定于3ml浴皿中,保持靜息張力為1g。浴皿中置37℃K-H液并持續(xù)通100%O2,每20分鐘換1次液,平衡1h。NE預(yù)處理兩次后洗至初始張力。在4個(gè)浴皿中分別加入蒸餾水,L-Arg(1×10-5mol/L),L-NLA(1×10-5mol/L),Ind(1×10-5mol/L)各3μl。溫孵10min后累積加入Phe(1×10-9～1×10-5mol/L)進(jìn)行收縮,平臺后累積加入Ach(1×10-10～1×10-5mol/L)進(jìn)行舒張。利用換能器及平衡記錄儀記錄張力的變化。2.3結(jié)果處理和統(tǒng)計(jì)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,統(tǒng)計(jì)學(xué)采用多樣本均數(shù)t檢驗(yàn)。3結(jié)果3.1高血壓大鼠abd-la的降壓藥,溫度穩(wěn)定的血管內(nèi)皮擴(kuò)張功能模型,見表1糖尿病大鼠主動脈環(huán)與正常大鼠相比對Phe敏感性加強(qiáng),尤其是在高濃度(1×10-6,1×10-5.5,1×10-5mol/L)。模型組的收縮強(qiáng)度分別為(1.08±0.08,1.18±0.09,1.22±0.08g)比正常組(0.74±0.08,0.80±0.08,0.86±0.08g)分別增加45.94%(P<0.05),47.5%(P<0.05)和41.86%(P<0.05)。說明糖尿病模型中,大血管有一定程度的痙攣。藥物治療后有不同程度改善。高劑量RB在相應(yīng)濃度的收縮分別是0.88±0.01,0.93±0.01,1.03±0.02g,較模型組改善58.82%(P<0.05),65.79%(P<0.05),52.78%(P<0.05)。格列本脲組則為0.80±0.02,0.89±0.03,0.99±0.02g,分別改善82.35%(P<0.05),76.32%(P<0.05),63.89%(P<0.05)。而低劑量RB作用不明顯(圖1)。—□—control;—●—model;—■—low;—◆—high;—▲—Gly糖尿病模型組主動脈對Ach敏感性下降,最大舒張百分比(Ach引起的最大舒張/Phe引起的最大收縮)明顯降低。在Ach濃度為1×10-6mol/L和1×10-5mol/L時(shí)模型組分別為(18.46±5.18)%,(26.63±5.93)%,較正常組(36.93±6.69)%,(49.37±5.95)%)減少50.01%(P<0.05),46.02%(P<0.05)。提示糖尿病模型可以減弱血管對Ach引起的舒張反應(yīng)。高劑量RB治療后Ach引起的舒張為(28.61±7.58)%,(44.21±4.76)%分別較模型組改善54.95%(P>0.05),77.30%(P<0.05),格列本脲組舒張為(25.61±4.89)%,(34.38±3.57)%僅改善了38.71%(P>0.05),34.08%(P>0.05)。在1×10-5mol/L時(shí)高劑量RB組改善優(yōu)于格列本脲,說明高劑量RB改善Ach誘導(dǎo)內(nèi)皮舒張功能作用強(qiáng)于格列本脲。低劑量RB組改善不明顯(圖2)。—□—control;—●—model;—■—low;—◆—high;—▲—Gly3.2是否參保風(fēng)-nla-ach,駁岸治療后的內(nèi)皮依賴性擴(kuò)張?jiān)谘h(huán)系統(tǒng)中,血管內(nèi)皮細(xì)胞自發(fā)釋放NO使血管保持一定的舒張狀態(tài),從而維持正常的血液循環(huán)。NO的這種釋放被稱為基礎(chǔ)釋放。NLA是NOS抑制劑能夠抑制NO生成,阻斷了NO誘導(dǎo)的舒張。NO合成阻斷后,Phe收縮強(qiáng)度加強(qiáng),在正常大鼠上升了0.25±0.03g,而模型大鼠只增加0.02±0.02g,兩者有顯著性差異(P<0.01),模型組較正常組減少了92%。提示在糖尿病模型中NO的基礎(chǔ)釋放比正常明顯降低。RB高劑量治療后Phe收縮強(qiáng)度增加了0.19±0.03g,說明NO的基礎(chǔ)釋放有一定恢復(fù),較模型改善了59%(P<0.01),格列本脲也恢復(fù)NO基礎(chǔ)釋放59%(P<0.01)。RB低劑量僅改善4.2%(表1)。Contractionresponsetophenylephrine(Phe1×10-5mol/L)intheabsenceandpresenceofL-argine(L-arg1×10-5mol/L)andN-Nitro-L-argine(NLA10-5mol/L).Abbreviation:NLA-Phe:NObasalrelease;Phe-L-Arg:NOmaximumrelease.*P<0.05,**P<0.01vscontrol,#P<0.05,##P<0.01vsmodel在Ach誘導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性舒張中,加入NLA后舒張減弱,減少部分反應(yīng)NO引起的舒張。在正常組NO誘導(dǎo)舒張為(30.33±5.56)%,模型組僅為(1.70±1.88)%,減少94%,RB高劑量和格列本脲治療后舒張分別為(18.72±3.18)%,(19.16±2.05)%,均改善40%左右(P<0.01)。低劑量組作用不明顯(表2)。Relaxantresponsetoacetylcholine(Ach1×10-5mol/L)intheabsenceandpresenceofN-Nitro-L-argine(NLA1×10-5mol/L),andindomethacin(Ind1×10-5mol/L)werecalculatedasapercentageofthephenylephrine-inducedcontraction.EDHFinducedrelaxationequalAch-NLA-Ind.*P<0.05,**P<0.01modelvscontrol,#P<0.05,##P<0.01vsmodel.Abbreviation:(Ach-NLA)/Ach:relaxationofNOinducedtorelaxationinducedbyAch;(Ach-Ind)/Ach:RateofrelaxationofPGI2inducedtorelaxationinducedbyAch;(Ach-NLA-Ind)/Ach:RateofrelaxationofEDHFinducedtorelaxationinducedbyAch3.3糖尿病大鼠合成nos的最適phe收縮通過加入L-Arg,可增加基礎(chǔ)狀態(tài)下NO的合成與釋放。由于NO的釋放增加,會使Phe引起的收縮減弱。此時(shí)減少部分反應(yīng)內(nèi)皮細(xì)胞對外源性L-Arg的利用能力,間接反應(yīng)NOS最大合成NO能力即NO最大釋放。正常組Phe收縮減少0.29±0.07g,而在模型組則減少0.04±0.03g,兩者有顯著性差異(P<0.01)。提示糖尿病大鼠對NO合成前體物質(zhì)精氨酸的反應(yīng)有明顯減弱。RB高劑量治療后較模型升高40%(P<0.01),而格列本脲與RB低劑量升高僅20%左右(P>0.05)(表1)。3.4rb對正常大鼠pgi2合成的影響PGI2是花生四烯酸在血管內(nèi)皮細(xì)胞中代謝的主要產(chǎn)物,是一種強(qiáng)烈的血管平滑肌舒張劑。Ind能抑制PGI2生成所引起的舒張。正常大鼠PGI2引起的舒張為21.33±5.14%,模型組則為6.50%±1.36%(P<0.05),降低了70%。說明糖尿病模型中PGI2合成或釋放比正常有所減少。RB高劑量治療后較模型改善與格列本脲相當(dāng)分別為61%(P<0.01),63%(P<0.01)。RB低劑量改善不明顯(表2)。3.5edhf誘導(dǎo)的ach-lg-l內(nèi)皮細(xì)胞依賴的舒張一般分為NO、PGI2及EDHF。Ach引起的血管舒張?jiān)跍胤鮊LA,Ind后不會完全抑制,血管仍有舒張,這部分舒張認(rèn)為是由EDHF引起。在本實(shí)驗(yàn)中,模型組NO及PGI2引起舒張減弱,Ach誘導(dǎo)舒張以EDHF為主,為91.88±1.5%。藥物治療后NO及PGI2舒張恢復(fù),EDHF引起的舒張占總內(nèi)皮依賴性舒張的比例趨于正常(表2)。4ach激動劑的作用機(jī)制長期以來,醫(yī)生和病人都把注意力集中在控制血糖上。然而,依據(jù)當(dāng)前對糖尿病理解,控制血糖雖然很重要,但不是導(dǎo)致并發(fā)癥唯一因素,單純降糖不能完全解決問題。所以在治療糖尿病時(shí),除血糖控制外還要考慮其他心血管危險(xiǎn)因素。本實(shí)驗(yàn)中,糖尿病大鼠主動脈環(huán)對Phe反應(yīng)張力顯著高于正常對照組大鼠。表明Ⅰ型糖尿病在12周時(shí)就已出現(xiàn)主動脈收縮反應(yīng)變化。糖尿病大鼠對腎上腺素收縮反應(yīng)增強(qiáng)可能是對α受體親和力、敏感性加強(qiáng)及兒茶酚胺類物質(zhì)濃度較正常濃度升高有關(guān),更主要是由于內(nèi)皮細(xì)胞受損,舒張功能減弱而導(dǎo)致收縮功能增加。對Phe收縮反應(yīng)增加提示在糖尿病早期,這種血管反應(yīng)性增強(qiáng)可能是糖尿病易發(fā)展成高血壓的原因之一。NO的合成是以L-精氨酸與分子氧為底物,在NOS的作用下生成NO與瓜氨酸。在體內(nèi)瓜氨酸參與鳥氨酸循環(huán)產(chǎn)生內(nèi)源性精氨酸,內(nèi)源性精氨酸作為NO合成底物,參與NO基礎(chǔ)釋放。激動劑Ach引起的NO釋放與NO的基礎(chǔ)釋放有所不同,它是當(dāng)Ach與其受體結(jié)合后,激活內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)NO合成酶(eNOS),使NO的合成迅速上升。NO擴(kuò)散出細(xì)胞漿,進(jìn)入平滑肌細(xì)胞,作用于其受體鳥苷酸環(huán)化酶(GC)使cGMP含量上升,通過cGMP第二信使的作用舒張血管平滑肌。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,糖尿病組與正常組相比,NO基礎(chǔ)釋放減少,Ach誘發(fā)的NO釋放減少及對外源性L-精氨酸的反應(yīng)減弱,可能是糖尿病使血管舒張功能降低的原因。血管內(nèi)皮NOS(eNOS)是鈣依賴性的,糖尿病模型中IP3水平以及對鈣-鈣調(diào)素活性相對抑制,造成NOS活性下降。NOS活性的相對降低導(dǎo)致NO的釋放減少。PGI2是血管壁環(huán)加氧酶主要產(chǎn)物,內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的比血管平滑肌產(chǎn)生的多10～20倍,所以其主要是內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)物。具有擴(kuò)血管,抑制血小板聚集,并作為一種天然保護(hù)因子來防止動脈粥樣硬