高脂喂養(yǎng)聯(lián)合低劑量sz誘導的2型糖尿病大鼠模型的建立

高脂喂養(yǎng)聯(lián)合低劑量sz誘導的2型糖尿病大鼠模型的建立

糖尿病是一種嚴重的發(fā)病率、長期病史和難治性疾病之一。糖尿病及其慢性并發(fā)癥的研究已成為研究熱點。操作簡單、可操作性強、造模周期短的糖尿病大鼠模型可以在很大程度上縮短實驗周期,節(jié)約實驗費用。本實驗通過建立接近人類糖尿病病理生理特點的大鼠模型,并觀察其代謝特征。從而為今后的研究打下基礎。1材料和方法1.1實驗動物和動物鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)購自Sigma公司;拜安捷血糖儀購于拜耳公司;大鼠胰島素放免試劑盒購自Linco公司;TNF-α放免試劑盒購自解放軍總醫(yī)院東亞免疫所;雄性Wistar6~7周齡大鼠,購自軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心,體重156~195g,平均174.8g?；A飼料(碳水化合物占重量的53%,脂肪占4%,蛋白質占18%,纖維素、微量元素、水分等占25%)及高脂飼料(基礎飼料加27%的煉豬油,脂肪占總熱量的50%左右)均購自軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心。1.2糖尿病模型的建立將35只雄性Wistar大鼠隨機分為兩組,正常對照組(NC,n=15)和糖尿病造模組(DM,n=20)。NC組喂以基礎飼料,DM組喂以高脂飼料,高脂飼料配方參考文獻方法并稍作改動。糖尿病模型的建立參照文獻方法進行。DM組以鏈脲佐菌素(STZ)30mg/kg體重一次性腹腔內注射;1周后測血糖,空腹血糖(FBG)均>11.1mmol/L,并出現(xiàn)多飲、多尿癥狀為成模標準,造模成功大鼠共15只,繼續(xù)予高脂飼料喂養(yǎng)。除實驗過程中因麻醉意外死亡、血標本溶血等因素予以剔除的動物外,最后進入統(tǒng)計的各組動物共24只,其中正常組及糖尿病組各12只。各組大鼠于17周末隔夜禁食后均以3%戊巴比妥鈉按0.15mL/kg腹腔注射麻醉,腹主動脈取血,分離血清后-80℃冰箱保存待測。1.3糖化血紅蛋白和血清胰島素動物飼養(yǎng)期間FBG用拜耳公司拜安捷血糖儀檢測,靜脈空腹血糖及甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、糖化血清蛋白(GSP)等生化指標用日立7600全自動生化分析儀檢測。糖化血紅蛋白(HbA1c)采用BIO-RAD公司VARIANTⅡ分析儀測定,血清胰島素(FIN)用放免試劑盒檢測。胰島素抵抗的判定:在所有誘導成功的糖尿病模型中,大鼠空腹血糖水平較對照組顯著升高,用穩(wěn)態(tài)模型法計算ISI,ISI=Ln(1/FBSXFINS),并計算Homa胰島素抵抗指數(shù)(Homa-IR),Homa-IR=FBS×FINS/22.5,與正常對照組比較具有顯著差異,滿足上述條件,則可認定該組大鼠已產(chǎn)生明顯胰島素敏感性下降。1.4方差分析方法統(tǒng)計學處理采用SPSS10.0完成,正態(tài)分布計量資料以xˉ±sxˉ±s表示,多組間比較采用方差分析,兩組間比較采用t檢驗。非正態(tài)資料用中位數(shù)(四分位數(shù))表示,組間比較采用成組資料的秩和檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。2結果2.1一般情況下糖尿病造模成功后,可見DM組尿量較NC組明顯增多,而體重有所減輕(見圖1),精神狀態(tài)及毛色較NC組差。2.2不同統(tǒng)計學差異STZ注射后1周,大鼠血糖明顯上升,與正常對照組相比其升高有統(tǒng)計學差異。此后DM組血糖一直保持較高水平并逐漸上升,實驗結束時DM組血糖維持在(22.7±3.23)mmol/L(見表1,圖2)。2.3實驗結果動物homa-ir、tg、tc的比較與NC組比較,DM組大鼠FBG、TG、HbA1c、GSP含量升高(P<0.01),ISI降低,Homa-IR升高(P<0.05)。實驗結束處死動物時測得的TNF-α值,DM組顯著高于NC組,兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。DM組大鼠TG、TC較NC組顯著升高,兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見表2)。與正常對照組比較,*P<0.05,**P<0.013糖尿病大鼠模型建立方法胰島素分泌減少和胰島素敏感性下降是糖尿病中極為重要的兩個因素。本實驗參照文獻方法并稍作改動制造糖尿病動物模型。在高脂高熱量飼養(yǎng)的基礎上腹腔一次性注射低劑量STZ(30mg/kg),造成部分胰島β細胞破壞,形成糖尿病動物模型。該模型不僅表現(xiàn)胰島素抵抗,且有胰島β細胞受損導致的胰島素分泌缺陷,糖代謝紊亂。與人類糖尿病臨床特點類似。該模型比以往研究報道的先用小劑量STZ尾靜脈注射相比,操作更容易、死亡率低、成功率高,是研究糖尿病較理想的模型。本實驗中,STZ注射后1周糖尿病組大鼠平均空腹血糖達到15.48mmol/L,且表現(xiàn)出多飲、多尿等癥狀,表明糖尿病造模成功。在以后的幾次空腹血糖監(jiān)測中,糖尿病組大鼠空腹血糖持續(xù)上升,到實驗結束時平均22.57mmol/L,而且在造模成功11周后,DM組大鼠HbA1c、GSP、TG、TC明顯高于NC組,ISI較NC組顯著下降,證明該糖尿病模型能夠適當模擬糖尿病的發(fā)病發(fā)展過程,亦說明該實驗的造模方法安全、穩(wěn)定。以往文獻中關于糖尿病大鼠模型的建立方法,可分為兩種,分別為一次性大劑量STZ(50~60mg/kg)注射法和一次性低劑量STZ注射法(25~30mg/kg)。前者造模周期短,但所造模型血糖較高,代謝紊亂癥狀重,其代謝特征更接近于1型糖尿病,而后者所造模型血糖中等度升高、且可有體重增加、高胰島素血癥等代謝特點,其代謝特征更接近于2型糖尿病。但本研究中,采用高脂喂養(yǎng)聯(lián)合低劑量STZ(30mg/kg)一次性腹腔注射造模,而所造模型卻具有如下特點:(1)在給予STZ注射后1周,DM組大鼠呈現(xiàn)了高血糖趨勢,其平均血糖達15~16mmo/L,顯著高于NC組(平均血糖6mmol/L左右)。且在其后的喂養(yǎng)過程中,DM組血糖持續(xù)升高,到實驗結束時,其平均血糖達22~23mmo/L,顯著高于NC組(平均血糖7mmol/L左右),見表1,圖1。(2)DM組大鼠體重并未出現(xiàn)升高,反而有一定程度的下降,見圖1。(3)DM組大鼠死亡率達25%。(4)DM組大鼠并未出現(xiàn)高胰島素血癥狀態(tài),見表2。以上特點與以往文獻報道存在一定差異。分析其原因可能與實驗動物體質及藥物來源不同相關,也可能與飼料制作工藝及動物食欲有關,有待于進一步研究。此外,關于DM組空腹血清胰島素與正常對照組無明顯統(tǒng)計學差異,未出現(xiàn)高胰島素血癥的狀態(tài)。分析原因可能有以下幾點:(1)糖尿病組大鼠成模后血糖逐漸升高,長期高血糖的糖毒性會進一步損害胰島β細胞,導致胰島素分泌下降。(2)在實驗結束留取血清時可能有少量溶血以致測得的胰島素值低于其實際值。此外,STZ腹腔注射后糖尿病鼠體重下降明顯,可能存在能量消耗過多導致的機體營養(yǎng)不良,原因可能與STZ劑量及給藥時間有關,有報道不同的STZ劑量和給藥時間造成的糖尿病模型血糖及相關生化指標有一定差異。綜之,本實驗證明了高脂喂養(yǎng)聯(lián)合小劑量STZ腹腔注射能夠造出較穩(wěn)定的與人類糖尿病發(fā)病特點類似的糖尿病模型,并對其代謝特征進行了研究,結果發(fā)現(xiàn)采用高脂喂養(yǎng)