幾種因素組合對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性糖尿病腎病模型建立的影響

幾種因素組合對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性糖尿病腎病模型建立的影響

糖尿病是一種慢性性?xún)?nèi)在疾病和代謝性疾病。該病嚴(yán)重，發(fā)病率高。它伴有著眼、腎、心、腦等各種器官的并發(fā)癥。糖尿病腎病(Diabeticnephropathy,DN)是糖尿病常見(jiàn)的慢性并發(fā)癥之一,由糖尿病微血管病變引起。DN確切的發(fā)病機(jī)制至今尚未闡明,可能是多因素協(xié)同作用的結(jié)果,尤其是自由基的作用不容忽視。在糖尿病動(dòng)物和細(xì)胞培養(yǎng)模型中越來(lái)越多的證據(jù)表明,自由基和有效的氧化劑過(guò)氧化亞硝酸鹽(超氧陰離子基團(tuán)和氧化亞氮的產(chǎn)物)的共同作用使血液流動(dòng)代謝異常而導(dǎo)致DN。為闡明DN的發(fā)病機(jī)制,建立較為理想的DN動(dòng)物模型顯得尤為重要。目前,國(guó)內(nèi)外所進(jìn)行的糖尿病及其并發(fā)癥實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究多采用有糖尿病遺傳傾向的近交系純種動(dòng)物,但是這些動(dòng)物的來(lái)源少,飼養(yǎng)條件苛刻,并且其特點(diǎn)是遺傳因素在發(fā)病過(guò)程中占主導(dǎo)地位,與臨床上的2型糖尿病發(fā)病特征不完全吻合因此筆者采用高糖高脂飼料鏈脲佐菌素單腎切除、阿霉素等因素組合建立了DN動(dòng)物模型,觀察了這幾種因素對(duì)模型建立中大鼠血脂、糖化血紅蛋白(HBA1c)、腎功能及醛糖還原酶(AR)等指標(biāo)的影響,確定了建立DN大鼠模型的最佳方案。1材料和方法1.1清潔級(jí)大鼠大鼠45d~50d齡的♂Sprague-Dawley清潔級(jí)大鼠,體重200g~250g;高糖高脂飼料:普通飼料∶白糖∶豬油∶雞蛋=70∶9∶12∶9,均由第三軍醫(yī)大學(xué)野戰(zhàn)外科研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。1.2超氧化物歧化酶及丙二醛試劑盒STZ(美國(guó)Calbiochem公司);阿霉素注射液(浙江海正藥業(yè)股份有限公司);速眠新注射液(長(zhǎng)春農(nóng)牧大學(xué)獸醫(yī)研究所);超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程公司);NADPHNa2、NADPHNa4(美國(guó)Biosharp公司);DL-甘油醛(德國(guó)CarlRoth公司)。1.3全自動(dòng)生化分析方法UV-2450型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本Shimadzu公司);7150型全自動(dòng)生化分析儀(日本Hitachi公司);960CRT型熒光分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。1.4主要指標(biāo)和實(shí)驗(yàn)方法1.4.1阿霉素給藥A組為正常組,以普通飼料喂養(yǎng);B為高糖高脂飼料組;C組為高糖高脂飼料+STZ組,以高糖高脂飼料喂養(yǎng)6wk后,腹腔注射STZ;D組為高糖高脂飼料+阿霉素+STZ組,以高糖高脂飼料喂養(yǎng)4wk后,腹腔注射阿霉素,2wk后注射STZ;E組為高糖高脂飼料+單腎切除+STZ組,以高糖高脂飼料喂養(yǎng)4wk后,單腎切除,2wk后注射STZ。單腎切除:大鼠實(shí)驗(yàn)前禁食12h,腹腔注射速眠新注射液1.0ml/kg(體重),麻醉后消毒腹部,沿腹中線切開(kāi)皮膚及肌肉,手術(shù)縫線沿腎蒂結(jié)扎左腎血管,剪掉腎臟,手術(shù)針縫合,肌肉注射青霉素2萬(wàn)IU,單籠飼養(yǎng),再肌肉注射青霉素2萬(wàn)IU,2次/d,連續(xù)1wk。阿霉素給藥方法:大鼠實(shí)驗(yàn)前禁食12h,腹腔注射阿霉素4mg/kg(體重),1wk后再給予3.5mg/kg。STZ給藥方法:大鼠實(shí)驗(yàn)前禁食12h,STZ臨用前以0.1mmol/L枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液(pH4.6)配制成濃度為5%的溶液,按40mg/kg(體重)劑量腹腔內(nèi)注射。1.4.2hba1c的檢測(cè)大鼠造模后12wk禁食12h,腹腔注射速眠新注射液1.0ml/kg,心臟取血,分裝于抗凝與促凝管中,測(cè)HBA1c、胰島素、血肌酐(CREA)、尿肌酐、尿素(UREA)、膽固醇(CH)、甘油三酯(TG)、白蛋白(ALB)、腎小球?yàn)V過(guò)率(GFR)等。HBA1c測(cè)定采用免疫比濁法,胰島素測(cè)定采用電化學(xué)發(fā)光法,ALB測(cè)定采用溴甲酚綠法,其余生化指標(biāo)測(cè)定采用酶法。1.4.3dl-甘油醛/nadph檢測(cè)(1)NADPH標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。準(zhǔn)確稱(chēng)取5mgNADPH置于10ml容量瓶中,加雙蒸水至刻度,分別稀釋得到濃度為0.06、0.6、6.0、12、18μmol/L的溶液,于367nm/455nm波長(zhǎng)處檢測(cè)熒光強(qiáng)度(AR標(biāo)準(zhǔn)曲線:Y=0.04588+0.04532X,r=0.9985,其中Y為熒光強(qiáng)度,X為濃度)。(2)取血樣1ml,加肝素抗凝管,離心(1500g)10min,紅細(xì)胞用10倍體積的等滲鹽水沖洗3次,加4倍體積10mmol/L的磷酸鉀緩沖液(pH6.0)振蕩10min,使之完全溶血,溶血液離心(10000g)30min以除去細(xì)胞有形成分。(3)最終測(cè)定濃度的配制。加入67mmol/L的鈉-鉀磷酸緩沖液(pH7.0),0.2mol/L磷酸胺,0.1mmol/LNADPH,10mmol/LDL—甘油醛和紅細(xì)胞溶血液10μl,總體積1.0ml,空白管以雙蒸水代替DL-甘油醛。(4)在37℃水浴中加熱反應(yīng)5min,加入0.3mol/LNaOH2ml終止反應(yīng)。充分混勻后,60℃下加熱15min,破壞NADP+,然后加入11.8mol/LNaOH(內(nèi)含0.01%H2O2)3.0ml充分混勻,經(jīng)37℃下保溫60min后,在367nm/455nm波長(zhǎng)處測(cè)定相對(duì)熒光強(qiáng)度,從NADPH熒光測(cè)定工作曲線上讀出NADPH。1IU酶活性表示1min內(nèi)1μmolNADPH被氧化的酶量,每份標(biāo)本的AR活性用IU/gHb表示。1.4.4sed和mda的測(cè)量1.5統(tǒng)計(jì)方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果以表示,采用方差分析比較,組間差異采用q檢驗(yàn),以P<0.05作為差異具有顯著性的標(biāo)準(zhǔn),采用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析。2各組大鼠尿胱被調(diào)指標(biāo)表1因D組大鼠存活率太低,故以下結(jié)果中無(wú)該組數(shù)據(jù)。各組各指標(biāo)測(cè)定結(jié)果詳見(jiàn)表1(其中GFR=尿肌酐×每分鐘尿量/血肌酐)。由表1可見(jiàn),HBA1c以E組最高,C組與E組、A組與B組之間無(wú)顯著性差異,A、B組與C、E組有顯著性差異;ALB以B組最高,B組與A、C、E組之間有顯著性差異,C組與E組間無(wú)顯著性差異;CH以C組最高,C組與E組無(wú)顯著性差異,A組與B、C、E組間有顯著性差異,B組與C、E組間有顯著性差異;TG以E組最高,A組與B、C、E組有顯著性差異,B組與C、E組有顯著性差異,C組與E組有顯著性差異;尿肌酐B、C、E組與A組比較有顯著性差異;UREA以E組最高,A組與B組無(wú)顯著性差異,與C、E組有顯著性差異,B組與C、E組有差異,C組與E組有顯著性差異;CREAA組與B、C組無(wú)顯著性差異,與E組有顯著性差異,B組與C組無(wú)顯著性差異,與E組有顯著性差異,C組與E組有顯著性差異;GFR以E組最高,A組與B組無(wú)顯著性差異,與C、E組有顯著性差異,B組與C、E組有顯著性差異,C組與E組有顯著性差異。上述結(jié)果表明,高糖高脂飼料+單腎切除+STZ即E組對(duì)HBA1c、血脂、腎功能(包括GFR)的影響是最為顯著的,單純高糖高脂飼料對(duì)上述指標(biāo)的影響不顯著。2.2各組sod、b、e組建模后胰島素的變化各組大鼠MDA、SOD及胰島素的測(cè)定結(jié)果詳見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn),B、C、E組建模后MDA升高,與A組比較有顯著性差異,B組與C、E組有顯著性差異,C組與E組無(wú)顯著性差異;B、C、E組建模后SOD降低,與A組比較有顯著性差異;B、C、E組建模后胰島素升高,以E組值最高,與A組比較有顯著性差異,B組與C、E組間比較有顯著性差異;B、C、E組建模后升高以組升高最顯著與組比較有顯著性差異,B組與C組無(wú)顯著性差異,與E組有顯著性差異。綜上所述,E組建模后對(duì)MDA、SOD、胰島素和AR的影響最為顯著,其次為C組。3阿霉素的毒副反應(yīng)對(duì)于糖尿病及其并發(fā)癥的動(dòng)物模型的建立方法有多種,傳統(tǒng)類(lèi)似2型糖尿病的建模采用小劑量注射STZ配合高糖高脂飼料的方法進(jìn)行。應(yīng)用高糖高脂飼料的目的就是抑制葡萄糖向6-磷酸葡萄糖的分解轉(zhuǎn)化而加重糖代謝的紊亂,其中血脂升高是此類(lèi)模型的特征,與臨床2型糖尿病比較符合。胰島素抵抗發(fā)生后,只要胰腺能維持足夠高的胰島素分泌來(lái)克服胰島素抵抗,那么糖耐量將保持正常或輕度受損,而注射STZ后β細(xì)胞功能開(kāi)始衰竭,糖耐量將迅速惡化。大鼠注射阿霉素后,不僅有氨基苷類(lèi)抗菌藥物的腎毒性作用,而且還產(chǎn)生具極強(qiáng)氧化作用的自由基,造成微小腎臟病變模型。筆者在研究中發(fā)現(xiàn),由于阿霉素毒性太大,加上STZ對(duì)胰島β細(xì)胞功能的破壞,大鼠存活率低,不能作為常規(guī)的建模方法。而單腎切除后導(dǎo)致對(duì)側(cè)腎代償性增生,加速DN的形成,可節(jié)省造模和實(shí)驗(yàn)時(shí)間。無(wú)論是臨床研究還是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn),在糖尿病情況下常伴有活性氧產(chǎn)生增多或存在著抗氧化酶系統(tǒng)SOD、過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH)等的功能降低,致使腎組織中局部活性氧生成和清除之間的平衡被打破。SOD是體內(nèi)歧化超氧陰離子自由基的抗氧化酶,血清的SOD水平可以反應(yīng)體內(nèi)對(duì)自由基的中和及清除能力。MDA是最常見(jiàn)的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物,MDA的量可以衡量脂質(zhì)過(guò)氧化的程度,間接反映脂質(zhì)氧化所產(chǎn)生的活性氧水平。氧自由基代謝紊亂常發(fā)生在腎臟形態(tài)學(xué)改變之前的糖尿病早期氧自由基可能是通過(guò)損傷基底膜和血管內(nèi)皮細(xì)胞膜,也可能參與了糖尿病早期的腎小球血流動(dòng)力學(xué)的變化過(guò)程,最終導(dǎo)致腎功能障礙。本實(shí)驗(yàn)采用了幾種因素交叉組合建摸,并從血糖、尿微量ALB的漸進(jìn)性變化等方面進(jìn)行了觀察,結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1)單用高糖高脂飼料喂養(yǎng)可以使大鼠血脂升高。(2)高糖高脂飼料加用小劑量注射STZ可以顯著升高血脂,GFR、HBA1c、MDA、S