基于線粒體dna技術(shù)的雪豹panmaeauncia微衛(wèi)星遺傳多樣性分析

基于線粒體dna技術(shù)的雪豹panmaeauncia微衛(wèi)星遺傳多樣性分析

流域主要分布在亞洲12個(gè)國家的高海拔山區(qū)（sunquitandsunquit，2002）。與世界其他貓科動(dòng)物一樣，雪豹也受到密度低、活動(dòng)范圍廣、獵物數(shù)量減少、狩獵和其他因素的威脅。由于受到地理范圍、難以捕獲等原因的限制,目前關(guān)于雪豹的生態(tài)行為、詳細(xì)分布范圍、生存現(xiàn)狀和種群狀況等的研究報(bào)道很少。有關(guān)雪豹的研究僅依賴于間接的證據(jù),例如痕跡(例如足跡、擦痕、尿跡、抓痕等)和對(duì)當(dāng)?shù)鼐用竦淖咴L等(Schaller,1998;Ale,2007)。痕跡僅能對(duì)雪豹種群提供定性的數(shù)據(jù),而不能跟蹤監(jiān)測(cè)雪豹種群的數(shù)量波動(dòng)(WilsonandDelahay,2001)。Jacksonetal.(2006)應(yīng)用紅外照相監(jiān)測(cè)技術(shù)在印度Ladakh的Hemis國家公園進(jìn)行了雪豹數(shù)量調(diào)查研究,但該技術(shù)存在野外工作時(shí)間長、難以在崎嶇的雪豹棲息地架設(shè)照相機(jī)和移動(dòng)照相機(jī)、以及費(fèi)用高等缺點(diǎn)。近年來,隨著分子生物學(xué)技術(shù)的日益發(fā)展,分子生物學(xué)研究和越來越多的學(xué)科相結(jié)合,大大擴(kuò)展了原有的研究范圍。糞便DNA分析技術(shù)以動(dòng)物的糞便為研究材料,應(yīng)用分子生物學(xué)手段研究動(dòng)物的DNA,從而獲得有關(guān)動(dòng)物的遺傳信息,這是一項(xiàng)新發(fā)展起來的保護(hù)遺傳學(xué)研究技術(shù)(王戎疆,2001)。通過對(duì)糞便DNA中多種遺傳標(biāo)記的識(shí)別,研究者可以對(duì)野生動(dòng)物的種群數(shù)量調(diào)查、領(lǐng)域邊界劃定、生活史、種群遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性等方面進(jìn)行深入的研究(魏輔文等,2001;吳、張恩迪,2005),研究者越來越普遍應(yīng)用非損傷性采樣(糞便和毛發(fā)等)和分子方法研究瀕危物種的遺傳多樣性(WaitsandPaetkau,2005;Schwartzetal.,2007),這為雪豹的種群監(jiān)測(cè)和遺傳多樣性研究提供了有效的途徑。本研究通過應(yīng)用雪豹線粒體、微衛(wèi)星位點(diǎn)和Y-染色體的特異性引物,對(duì)3個(gè)雪豹分布地理隔離區(qū)的糞便樣品進(jìn)行物種和性別鑒定,利用篩選的微衛(wèi)星引物進(jìn)行遺傳多樣性初步研究,試圖建立適合于雪豹種群監(jiān)測(cè)和遺傳多樣性研究的非損傷性方法,為開展大范圍的雪豹種群研究和制定保護(hù)策略提供科學(xué)依據(jù)。1材料和方法1.1調(diào)查區(qū)域和方法于2005年分別在中國、印度和蒙古3個(gè)獨(dú)立的雪豹隔離分布區(qū)采集雪豹的糞便樣品109份,其中印度的Ladakh32份、中國青海省都蘭縣50份、蒙古國的南Gobi27份。在每個(gè)樣品采集區(qū),采集樣品的范圍約25km2,由當(dāng)?shù)亟?jīng)驗(yàn)豐富的居民引導(dǎo)。Ladakh的調(diào)查區(qū)域在海拔3950-4420m,青海為3135-3930m,南Gobi為2000-2500m。所有糞便樣品保存在含有大約12ml硅膠的15ml試管中,室溫保存。應(yīng)用QiagenStoolDNA試劑盒(Qiagen,Valencia,California,USA)提取糞便樣品DNA,同時(shí)以圣地亞哥動(dòng)物園和瀕危物種繁殖中心的2個(gè)雪豹(1雌1雄)冰凍組織樣品作為對(duì)照。1.2pcr擴(kuò)增選擇線粒體cytb基因的通用引物(Farrelletal.,2000)進(jìn)行糞便樣品的鑒定,該引物的擴(kuò)增產(chǎn)物約為148bp。PCR反應(yīng)體積為10μl,體系中含有0.2mmol/L的dNTPs、1×PCRbuffer,0.25U的HotMasterTMTaq(Eppendorf),1μg的BSA,0.24mmol/L的引物和1μl模板DNA。PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性1min,94℃變性30s,55℃退火30s,72℃延伸1min,50個(gè)循環(huán),最后72℃延伸2min。應(yīng)用1.2%瓊脂糖凝膠電泳,PrepEasePCR(USBCorporation,USA)試劑盒純化PCR產(chǎn)物,然后將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序后的DNA序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比較,以確定糞便樣品的來源物種。1.3ss-pcr擴(kuò)增經(jīng)鑒定后確定的雪豹糞便樣品,應(yīng)用Janekaetal.(2008)新設(shè)計(jì)的7對(duì)微衛(wèi)星引物進(jìn)行雪豹樣品的基因分型分析。PCR擴(kuò)增體系為10μl,反應(yīng)體系體系中含有0.2mmol/L的dNTPs、1×PCRbuffer,0.25U的HotMasterTMTaq(Eppendorf),1μg的BSA,0.24mmol/L的正向熒光標(biāo)記引物和0.24mmol/L的反向引物,1μl模板DNA。PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性1min,94℃變性30s,55℃退火30s,72℃延伸1min,50個(gè)循環(huán),最后72℃延伸2min。PCR產(chǎn)物在ABI3730測(cè)序儀上分型分析,通過GeneMapper(Version4.0;AppliedBiosystems)確定等位基因大小。只得到一條PCR產(chǎn)物帶的判定為純合子,有2條產(chǎn)物帶的判定為雜合子。1.4資料處理和分子鑒定對(duì)所有鑒定后確定的雪豹糞便樣品,進(jìn)行性別鑒定。應(yīng)用貓科動(dòng)物的特異性引物(Murphyetal.,1999)進(jìn)行性別鑒定,擴(kuò)增產(chǎn)物為200bp的AMYELY基因片段。PCR條件與上述的線粒體DNA條件相同,每個(gè)擴(kuò)增設(shè)置3個(gè)重復(fù),并有1雄、1雌作為陽性和陰性對(duì)照。用1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)PCR產(chǎn)物,3個(gè)重復(fù)中至少有2個(gè)具有明顯擴(kuò)增產(chǎn)物的樣品被判定為雄性,如果3個(gè)重復(fù)中都沒有產(chǎn)物的被判定為雌性。1.5pcr檢測(cè)ndb基因的多樣性通過Sequencher進(jìn)行線粒體DNA序列分析,去掉測(cè)序產(chǎn)物中的引物和不明確的片段,與GenBank數(shù)據(jù)庫中找到的參照序列在ClustalW1.83中進(jìn)行比對(duì)。為了檢測(cè)線粒體DNA的序列差異,應(yīng)用DNASP4.0進(jìn)行堿基的配對(duì)和單倍型分析,并計(jì)算mtDNA序列的單倍型多樣性和核苷酸多樣性(π)等。應(yīng)用7對(duì)微衛(wèi)星位點(diǎn)引物,對(duì)cytb基因分析確認(rèn)的雪豹樣品進(jìn)行了基因分型。當(dāng)3個(gè)PCR重復(fù)中獲得至少2個(gè)清楚的PCR產(chǎn)物,并且每個(gè)等位基因觀察到2次或以上,而純合子的等位基因觀察到3次時(shí),確定為基因分型成功。應(yīng)用GenAlex(Version6.0)計(jì)算微衛(wèi)星的等位基因數(shù)(AN)、觀察雜合度(HO)、預(yù)期雜合度(HE)和哈溫平衡。2不同性別和異質(zhì)性的基因型分析所有采集的糞便樣品中,80%的樣品獲得了良好的擴(kuò)增結(jié)果,可以用于物種鑒定,成功率為72%-89%。在鑒定的Ladakh的32個(gè)樣品中有17個(gè)確定是雪豹,其它有6個(gè)赤狐和2個(gè)狼/狗;來自青海的36個(gè)樣品中有3個(gè)為雪豹、10個(gè)猞猁、21個(gè)赤狐,另外2個(gè)樣品為狼或狗;而蒙古國南Gobi的24個(gè)樣品中有11個(gè)雪豹和13個(gè)赤狐。在3個(gè)地區(qū)的雪豹樣品中僅得到1個(gè)cytb基因的單倍型,而猞猁中有2個(gè)(π=0.030),赤狐中有4個(gè)(π=0.017),狼/狗中有2個(gè)(π=0.010)單倍型。利用篩選到的7對(duì)雪豹微衛(wèi)星引物,對(duì)確定的31個(gè)雪豹糞便樣品進(jìn)行基因分型,通過個(gè)體識(shí)別,確定這些樣品中的真正雪豹數(shù)量。印度Ladakh和蒙古國南Gobi的基因分型成功率分別為12個(gè)(71%)和9個(gè)(82%)(表1),青海為1個(gè)。在Ladakh和南Gobi的樣品中,總共檢測(cè)到9個(gè)不同的基因型:Ladakh有4個(gè),南Gobi為5個(gè)。因此,在Ladakh中的雪豹糞便樣品分別來自4只不同的雪豹個(gè)體,而南Gobi中雪豹糞便樣品則來自5只不同的雪豹個(gè)體(表1)。為了確定檢測(cè)到的雪豹的性別,使用與Y染色體的AMELY基因進(jìn)行了性別鑒定,結(jié)果在Ladakh樣品中檢測(cè)到2只雄性和2只雌性雪豹,而南Gobi樣品檢測(cè)到3只雄性和2只雌性雪豹(表1),在青海省的樣品中檢測(cè)到1只雄性雪豹。應(yīng)用7對(duì)特異性微衛(wèi)星引物進(jìn)行遺傳多樣性研究,分別計(jì)算了各個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)、觀察的雜合度、預(yù)期的雜合度和哈溫平衡等(表2)。結(jié)果表明:7個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在Ladakh和南Gobi樣品中均具有多態(tài)性,等位基因數(shù)為2-4個(gè),其中PUN327位點(diǎn)在兩地樣品中的等位基因數(shù)均最多,而PUN82位點(diǎn)在兩地樣品中的等位基因數(shù)均最少,Ladakh和Gobi樣品的平均等位基因數(shù)分別為3.1和2.5。在Ladakh樣品中共檢測(cè)到9個(gè)特異等位基因,分別來自PUN124、PUN132、PUN225、PUN229和PUN327;而南Gobi樣品檢測(cè)到5個(gè)特異等位基因,分別來自PUN124、PUN132、PUN229和PUN327。因此,在PUN124、PUN132、PUN229和PUN327這些微衛(wèi)星位點(diǎn),更容易產(chǎn)生變異,具有更高的多態(tài)性。在Ladakh和Gobi樣品中觀察的平均雜合度分別為0.75和0.51,而預(yù)期的雜合度分別為0.58和0.44。因此,等位基因數(shù)和雜合率在南Gobi樣品中都較低,同時(shí),所有的微衛(wèi)星位點(diǎn)都符合哈溫平衡,Ladakh和Gobi區(qū)域的FST值是0.171。3檢測(cè)的準(zhǔn)確性和非損傷性本研究應(yīng)用線粒體DNAcytb基因通用引物進(jìn)行糞便樣品的物種鑒定研究,該引物曾經(jīng)被成功地用于南美洲肉食動(dòng)物等的糞便樣品鑒定。本研究的結(jié)果表明,該引物同樣適用于亞洲雪豹、赤狐、狼/狗和猞猁等糞便樣品的物種鑒定。通過cytb基因引物成功地鑒定了80%的糞便樣品,與其它的肉食動(dòng)物的研究平均值相近(85.7%;Broquetetal.,2007)。青海的取樣區(qū)檢測(cè)到的雪豹糞便最少,僅為3個(gè)糞便樣品,而且鑒定成功率也最低,這可能是由于該地區(qū)的糞便樣品在野外暴露的時(shí)間過長,或者是受到雨水沖刷等原故。而鑒定的樣品中,赤狐和猞猁的數(shù)量均比雪豹數(shù)量高,因此,該地區(qū)可能有較多的赤狐和猞猁數(shù)量。而蒙古國的南Gobi地區(qū)得到的赤狐和雪豹樣品基本相等,而且狐貍的糞便樣品都是有規(guī)律地在雪豹的痕跡地點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)。因此,利用這些糞便樣品進(jìn)行物種鑒定是可靠的。在經(jīng)過cytb基因成功鑒定后的樣品中,應(yīng)用7個(gè)微衛(wèi)星引物分別在印度Ladakh的17個(gè)糞便樣品中檢測(cè)到4個(gè)不同的基因型,而蒙古國南Gobi的11個(gè)糞便樣品中有5個(gè)不同的基因型,青海都蘭的3個(gè)糞便樣品中僅檢測(cè)到1個(gè)基因型。因此,在相同面積的樣品收集區(qū)域內(nèi),蒙古國南Gobi和印度Ladakh可能存在較青海地區(qū)更大的雪豹種群。盡管此次研究中最后共計(jì)只得到10個(gè)雪豹個(gè)體樣品,但取樣區(qū)均在25km2范圍內(nèi),根據(jù)貓科動(dòng)物的活動(dòng)習(xí)性,不可能有更多的雪豹個(gè)體存在,因此,這兩個(gè)地區(qū)的雪豹種群密度實(shí)際上已經(jīng)較高。通過使用性別鑒定標(biāo)記基因,在印度Ladakh和蒙古國南Gobi檢測(cè)到的雌雄雪豹數(shù)量基本相同,這表明,在這兩個(gè)地區(qū)的雪豹種群中,雌雄性別比基本相同。由于本研究樣品收集的范圍較小,所以還不能完全確定該性別比的準(zhǔn)確性。微衛(wèi)星基因分型的錯(cuò)誤可能會(huì)對(duì)種群大小估計(jì)造成偏差(McKelveyandSchwartz,2004),已有的非損傷性(糞便、毛發(fā)樣品)研究表明,微衛(wèi)星分型分析中存在較多的等位基因丟失和假等位基因現(xiàn)象(Broquetetal.,2007),這些可能是由于非目標(biāo)DNA、目標(biāo)DNA質(zhì)量和數(shù)量較低以及PCR抑制等造成的(Taberletetal.,1999)。盡管這些原因?qū)е铝嘶蚍中偷腻e(cuò)誤,但是還不能完全解釋位點(diǎn)特異性的錯(cuò)誤(Broquetetal.,2007)。已有的非損傷性研究沒有考慮微衛(wèi)星重復(fù)單位的作用和微衛(wèi)星引物的序列差異,這可能是PCR不能進(jìn)行位點(diǎn)特異性擴(kuò)增、等位基因丟失和假基因等現(xiàn)象的原因(Lopex-Giraldezetal.,2006)。本研究使用根據(jù)家貓微衛(wèi)星位點(diǎn)引物重新設(shè)計(jì)的引物,降低了這種特異性錯(cuò)誤,從而表明等位基因丟失和假等位基因的現(xiàn)象可能是由于微衛(wèi)星引物區(qū)的基因突變等原因?qū)е碌?Janetal.,2008)。印度Ladakh和蒙古國南Gobi的雪豹糞便樣品在7個(gè)PUN引物中的基因分型成功率分別是75%和84%,高于其它非損傷性方法的研究結(jié)果(Broquetetal.,2007)。這7對(duì)重新設(shè)計(jì)的雪豹微衛(wèi)星引物具有較低的等位基因丟失和假等位基因現(xiàn)象,對(duì)Ladakh和南Gobi的雪豹糞便樣品的個(gè)體鑒定提供足夠的靈敏度(PID-sib<0.05)。如果使用更多的微衛(wèi)星位點(diǎn)將更加有利,特別是對(duì)遺傳多樣性水平較低的種群。由于有限的樣品數(shù)而無法進(jìn)行雪豹種群水平遺傳多樣性分析比較,盡管研究的3個(gè)樣品區(qū)距離遠(yuǎn)(>1000km)且有天然的地理阻隔(例如喜馬拉雅山脈等),但是沒有檢測(cè)到確定的單倍型差異。與線粒體相比較,7個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在印度Ladakh和蒙古國南Gobi樣品中的雜合度均處于中等程度,表明這2個(gè)種群都具有中度的多樣性。蒙古國南Gobi樣品的微衛(wèi)星多樣性水平低于印度Ladakh,然而,由于樣品數(shù)的限制而無法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較。本研究初步探討了3個(gè)獨(dú)立的雪豹棲息區(qū)域的糞便樣品,說明了使用糞便DNA分析方法在雪豹種群數(shù)量調(diào)查和遺傳多樣性研究中的