第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)

04第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)2023/12/1第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)

植物離體繁殖（propagationinvitro）又稱植物快繁或微繁，是指利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)，使其短期內(nèi)獲得遺傳性一致的大量再生植株的方法。一、概念和特點(diǎn)（一）概念I(lǐng)概述

2第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)1、繁殖效率高。2、培養(yǎng)條件可控性強(qiáng)。3、占用空間小。4、管理方便，利于自動(dòng)化控制。5、便于種質(zhì)保存和交換。（二）特點(diǎn)3第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)二、植物快繁器官形成方式（再分化形成植株的方式）根據(jù)器官形成方式的不同，將植物器官的再生分為五種類型，即短枝發(fā)生型（不定芽型）、叢生芽發(fā)生型（器官型）、器官發(fā)生性、胚狀體發(fā)生型和原球莖發(fā)生型。第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)（一）短枝發(fā)生型（不定芽型）

短枝發(fā)生型是指外植體攜帶的帶葉莖段，在適宜的培養(yǎng)環(huán)境中萌發(fā)，形成完整植株，再將其剪成帶葉莖段，繼代再成苗的繁殖方法。特點(diǎn)：①繁殖率高，利用外植體的芽特別是原受到抑制的腋芽和大量形成不定芽。②能保持該種植物遺傳穩(wěn)定性。③可使繁殖周期長(zhǎng)的林木縮短其童年期5第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)（二）叢生芽發(fā)生型(器官型)

叢生芽發(fā)生型是指使外植體攜帶的頂芽或腋芽在適宜培養(yǎng)環(huán)境中不斷發(fā)生腋芽而呈叢生狀芽，或者直接從外植體上長(zhǎng)出多個(gè)從芽，將單個(gè)芽轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)生根成苗的繁殖方法。叢生芽發(fā)生型是大多數(shù)植物快繁的主要途徑，它不經(jīng)過(guò)愈傷組織，能使無(wú)性系后代保持原品種的特性，在生產(chǎn)中普遍應(yīng)用。6第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)特點(diǎn)：①繁殖率非常高，但繁殖速度較慢。②遺傳性穩(wěn)定。7第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)（三）器官發(fā)生型（已講過(guò)）是指外植體在適宜培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，經(jīng)過(guò)脫分化形成愈傷組織，然后經(jīng)過(guò)再分化誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生不定芽，或外植體不形成愈傷組織而直接從其表面形成不定芽，將芽苗轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中，經(jīng)培養(yǎng)獲得完整植株的繁殖方法。①繁殖速度較快。②遺傳性不穩(wěn)定，已產(chǎn)生變異。③愈傷組織是遺傳轉(zhuǎn)化、細(xì)胞培養(yǎng)或原生質(zhì)體培養(yǎng)的良好材料第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)器官發(fā)生型也是許多植物快繁的主要方式。由于不定芽形成的數(shù)量與腋芽數(shù)目無(wú)關(guān)，其增殖率高于叢生芽發(fā)生型。但經(jīng)過(guò)愈傷組織途徑或者多次繼代培養(yǎng)后，容易導(dǎo)致細(xì)胞分裂不正常，增加變異植株發(fā)生頻率。如香蕉繼代次數(shù)控制在8代之內(nèi)，再生植株的變異率則可控制在3%左右。9第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)表現(xiàn)嵌合性狀的植株通過(guò)此方式再生時(shí)，往往導(dǎo)致嵌合性狀發(fā)生分離而失去原有價(jià)值。如觀賞植物色彩鑲嵌的葉子、帶金邊或者銀邊等性狀的植物，通過(guò)器官發(fā)生性途徑再生植株時(shí)，可能導(dǎo)致這些觀賞性狀消失。這類植株快繁時(shí)，應(yīng)通過(guò)叢生芽途徑進(jìn)行。10第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)ABEC花燭葉片離體培養(yǎng)及植株再生11第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)（四）胚狀體發(fā)生型

胚狀體發(fā)生型是指外植體在適宜培養(yǎng)環(huán)境中，經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生體細(xì)胞胚的繁殖方法，從而形成小植株的繁殖方法。分為間接途徑（經(jīng)愈傷途徑）和直接途徑兩種。胚狀體發(fā)生途徑具有成苗數(shù)量大、速度快、結(jié)構(gòu)完整的特點(diǎn)，因而是外植體增殖系數(shù)最大的途徑。12第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)胚狀體發(fā)生型特點(diǎn)：①胚狀體發(fā)生數(shù)量多、速度快、結(jié)構(gòu)完整、繁殖系數(shù)高。②遺傳性穩(wěn)定13第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)菊花花瓣體細(xì)胞胚胎發(fā)生及體胚發(fā)育過(guò)程的掃描電鏡觀察14第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)（五）原球莖發(fā)生型

原球莖發(fā)生型是蘭科植物的一種快繁方式，它是指莖尖或腋芽外植體經(jīng)培養(yǎng)產(chǎn)生原球莖（即扁球狀體、基部生假根）的繁殖類型。15第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)原球莖是蘭花種子發(fā)芽過(guò)程中的一種形態(tài)學(xué)構(gòu)造。種子萌發(fā)初期并不出現(xiàn)胚根，只是胚逐漸膨大，以后種皮的一端破裂，腫脹的胚呈小圓錐狀，故稱為原球莖。原球莖是短縮的、呈珠粒狀的、由胚性細(xì)胞組成的、類似嫩莖的器官，它可以增殖，形成原球莖叢。由莖尖或腋芽外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生原球莖，切割原球莖進(jìn)行增殖，或停止切割使其繼續(xù)培養(yǎng)而轉(zhuǎn)綠，產(chǎn)生毛狀假根，葉原基發(fā)育成幼葉，將其轉(zhuǎn)移培養(yǎng)生根，形成完整植株。16第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)17第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)植物快繁的程序包括四個(gè)階段：無(wú)菌（或初代）培養(yǎng)的建立繁殖體增殖芽苗生根小植株的移栽馴化II植物快繁程序18第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)一、無(wú)菌培養(yǎng)的建立這個(gè)階段的任務(wù)是母株和外植體的選取、無(wú)菌培養(yǎng)物的獲得及外植體的啟動(dòng)生長(zhǎng)，以利于離體材料在適宜培養(yǎng)環(huán)境中以某種器官發(fā)生類型進(jìn)行增殖。19第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)21第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)二、增殖培養(yǎng)1.培養(yǎng)材料的增殖方式五種方式。(取決于培養(yǎng)目的和材料自身的可能性。)一般大多數(shù)植物采用無(wú)菌短枝或腋芽萌發(fā)或誘導(dǎo)不定芽產(chǎn)生，再以芽繁殖芽的方式進(jìn)行增殖；蘭科植物、百合等則采用原球莖增殖途徑，以保障繁殖材料的遺傳穩(wěn)定性。22第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)2.增殖培養(yǎng)基增殖率是植株快速繁殖特別是商業(yè)性繁殖的重要指標(biāo)。外植體在每次繼代培養(yǎng)中，應(yīng)能產(chǎn)生最大數(shù)量的有效繁殖體?；九囵B(yǎng)基一般與啟動(dòng)生長(zhǎng)培養(yǎng)基相同，而細(xì)胞分裂素和礦物元素的濃度水平則高于啟動(dòng)生長(zhǎng)培養(yǎng)基。一般MS+BA1~3mg/ml+NAA0.1~1mg/ml。23第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)3.增殖體的大小和切割方法一般攜帶一個(gè)莖節(jié)，但第一次增殖的莖段一般都有2~4個(gè)莖節(jié)。莖段可以垂直插入培養(yǎng)基中，但插入的深度不應(yīng)淹沒(méi)莖節(jié)；或水平放入培養(yǎng)基表面，以刺激側(cè)芽的萌動(dòng)。24第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù) 青花菜增殖 枇杷增殖第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)26第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)27第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)三、芽苗生根

將單個(gè)芽苗轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基或適宜環(huán)境中誘導(dǎo)生根。1.離體生根（試管內(nèi)生根）降低無(wú)機(jī)鹽濃度（1/2MS或者1/4MS），減少或不需要細(xì)胞分裂素，增加生長(zhǎng)素的濃度。對(duì)有些植物，如果芽苗在含有生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)1～2d，再轉(zhuǎn)移至無(wú)生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基中，或芽苗在含生長(zhǎng)素的生根溶液中浸蘸后直接插入無(wú)生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基中，濕度85%以上，溫度25℃，弱光或黑暗條件。28第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)29第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)2.活體生根（試管外生根）

芽苗先在生長(zhǎng)素中快速浸蘸或在含有相對(duì)高濃度生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)5~10天，然后在溫室中栽入培養(yǎng)基質(zhì)，經(jīng)常噴霧，給予高濕度環(huán)境，幾天后便可自行生根。

30第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)四、移栽馴化

試管小植株的移栽馴化是試管苗從異養(yǎng)到自養(yǎng)的轉(zhuǎn)變，有一個(gè)逐漸適應(yīng)過(guò)程。移栽前需對(duì)試管植株進(jìn)行高光強(qiáng)煉苗，使植株生長(zhǎng)粗壯，并打開(kāi)瓶口，降低濕度，使其逐漸適應(yīng)外界環(huán)境。1.移栽2.馴化管理31第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)１.移栽

首先應(yīng)洗去小植株根部附著的培養(yǎng)基，避免微生物的繁殖污染，造成小苗死亡。然后將小植株栽入人工配制的混合培養(yǎng)基質(zhì)中，基質(zhì)用保濕又透氣的材料，如蛭石、珍珠巖、粗沙、泥炭等按比例混合，以利小植株生長(zhǎng)。幾天后小植株可形成新的功能根系。32第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)2.馴化管理

移栽的試管小植株和活體生根的小植株，其濕度的控制十分重要。因試管苗在高濕（90％～100％的相對(duì)濕度）環(huán)境中生長(zhǎng)，莖葉表面防止水分散失的角質(zhì)層等幾乎全無(wú)，根系又不發(fā)達(dá)，移栽后難以保證水分平衡，即使根系周圍有足夠的水分也不行。所以，應(yīng)采用加覆塑料薄膜、經(jīng)常噴霧的方法，提高小植株周圍的空氣濕度，減少葉面蒸騰。同時(shí)，逐漸降低空氣相對(duì)濕度，使其適應(yīng)自然環(huán)境條件。33第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)移栽小植株還應(yīng)注意光、溫控制。移栽初期光照強(qiáng)度應(yīng)較弱，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間適應(yīng)后，增加光照強(qiáng)度（漫射），如1500～4000lx，甚至10000lx。移栽小植株生長(zhǎng)所需的適宜溫度與植物種類有關(guān)，喜溫性植物以25℃左右為宜，喜涼性植物則以18～20℃為好。溫度過(guò)高導(dǎo)致蒸騰作用加強(qiáng)，水分失衡，微生物滋生等；溫度過(guò)低則使幼苗生長(zhǎng)遲緩或不易存活。如使基質(zhì)溫度高于空氣溫度2～3℃，則有利于生根和促進(jìn)根系發(fā)育，提高存活率。34第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)此外，在移栽小植株的馴化管理階段，還應(yīng)防止菌類滋生，適當(dāng)噴一定濃度的殺菌劑（殺菌靈）可有效保護(hù)移栽小植株的正常生長(zhǎng)。35第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)36第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)III影響植物快繁的因素植物快繁的目的是以盡可能高的效率生產(chǎn)試管苗，獲得最大的經(jīng)濟(jì)效益。因此，在快繁時(shí)應(yīng)使各種影響因素處于最適合快繁的狀態(tài)。37第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)一、外植體外植體的來(lái)源：最適的為莖尖、帶芽莖段，也可以利用葉片、子葉、根段、花器官組織等。外植體生理年齡：幼嫩組織分化能力更強(qiáng)。外植體大小：不能太小，否則影響成活率。除非是用于脫毒苗的生產(chǎn)。38第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)二、培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基應(yīng)用最為廣泛。對(duì)于某些植物及生根階段，以1/4或1/2MS較好。蔗糖和葡萄糖濃度為2-4%。生根時(shí)稍低。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑：主要以細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素的配合使用，調(diào)節(jié)外植體的生長(zhǎng)和分化。另外ABA、GA、CCC等也具有不同的作用。培養(yǎng)基的物理特性：以固體培養(yǎng)較為普遍，也有采用液體培養(yǎng)，如蘭花原球莖的增殖。39第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)三、培養(yǎng)條件光照：1000-3000lx，后期可增強(qiáng)。14-16h/d。溫度：與植物的原產(chǎn)地相應(yīng)。一般為25±2℃。有時(shí)可進(jìn)行高溫或低溫的預(yù)處理。濕度：要求環(huán)境相對(duì)濕度不能太低，一般在70-80%。氣體：要求培養(yǎng)基及培養(yǎng)瓶通氣良好，同時(shí)及時(shí)轉(zhuǎn)接。液體培養(yǎng)要求振蕩培養(yǎng)，促進(jìn)氧氣交換。40第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)四、繼代培養(yǎng)主要指對(duì)階段Ⅱ增殖形成的芽叢、胚狀體或原球莖等進(jìn)行轉(zhuǎn)接繼代。繼代間隔時(shí)間一般為20天左右。41第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)五、移栽根系結(jié)構(gòu)不完善的試管苗移栽后不易存活。要求根系結(jié)構(gòu)完整，具根毛，再生根的吸收能力強(qiáng)。葉表皮組織不發(fā)達(dá)的試管苗也不易移栽存活。移栽要求打開(kāi)瓶口馴化2-3天；或在瓶?jī)?nèi)添加一些生長(zhǎng)延緩劑如PP333、CCC等培育壯苗。42第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)IV植物快繁的商業(yè)化應(yīng)用

植物快繁最重要的用途是進(jìn)行植物的商業(yè)化生產(chǎn)。世界上快繁商業(yè)化開(kāi)始于上個(gè)世紀(jì)美國(guó)的蘭花工業(yè)。我國(guó)的香蕉快繁苗占全國(guó)組培苗的2/3。其次有甘蔗、蘭花、馬鈴薯、甘薯等。43第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)園藝植物種苗工廠化生產(chǎn)44第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)

一、商業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模及工藝流程1.試管苗生產(chǎn)規(guī)模的確定

商業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模的確定應(yīng)以市場(chǎng)需求為標(biāo)準(zhǔn)。

試管苗生產(chǎn)規(guī)模的確定是以無(wú)菌工作臺(tái)和培養(yǎng)架的數(shù)量來(lái)衡量的。年產(chǎn)100萬(wàn)株，接種室40~50m2，超凈工作臺(tái)8~10臺(tái)，培養(yǎng)室100-120m2

。45第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)2.商業(yè)化實(shí)驗(yàn)室的設(shè)計(jì)

根據(jù)已確定的生產(chǎn)規(guī)模和組織培養(yǎng)的生產(chǎn)程序，試管苗生產(chǎn)的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)盡量布局合理，使生產(chǎn)程序能連續(xù)、有效地進(jìn)行。（1）環(huán)境要求遠(yuǎn)離污染源（2）水電、交通（3）工藝流程（4）節(jié)能（5）無(wú)菌46第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)3.商業(yè)化生產(chǎn)的配套設(shè)施相應(yīng)配套設(shè)施包括過(guò)渡培養(yǎng)室和露地?zé)捗鐖?chǎng)。47第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)4.商業(yè)化生產(chǎn)的工藝流程試管苗商業(yè)化生產(chǎn)的工藝流程是以其快繁程序?yàn)榛A(chǔ)建立起來(lái)的，如最成熟的草莓脫毒苗生產(chǎn)流程和葡萄試管快繁流程。通過(guò)莖尖脫毒建立起來(lái)的草莓商業(yè)化試管苗生產(chǎn)，除必須配備的培養(yǎng)和馴化等條件外，還應(yīng)增加病毒鑒定室。48第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)二、商業(yè)化生產(chǎn)及效益分析1.試管苗增殖率的估算試管苗的增殖率多數(shù)以芽或苗為單位，但原球莖或胚狀體多以瓶為單位。（1）增殖率的理論值是指接種一個(gè)芽或一塊增殖培養(yǎng)物，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間培養(yǎng)后得到的芽或苗數(shù)。Y=mXn

（Y—年繁殖數(shù)，m—無(wú)菌母株苗數(shù)，X—每個(gè)培養(yǎng)周期增殖的倍數(shù)，n—全年可增殖的周期數(shù)）（2）增殖率的實(shí)際值是指接種一個(gè)芽或一個(gè)苗，經(jīng)過(guò)實(shí)際繁殖周期，得到的實(shí)際芽或苗數(shù)。實(shí)際增殖數(shù)與理論增殖數(shù)出現(xiàn)很大差異的原因是：①污染淘汰；②出售、轉(zhuǎn)讓和實(shí)驗(yàn)所用；③移栽死亡；④培養(yǎng)容器等設(shè)備的限制。49第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)2.生產(chǎn)計(jì)劃的制定和實(shí)施（1）生產(chǎn)計(jì)劃的制定

商業(yè)化生產(chǎn)計(jì)劃制定的依據(jù)是市場(chǎng)對(duì)試管苗的種類、品種及數(shù)量的需求及趨勢(shì)，實(shí)驗(yàn)室具備的生產(chǎn)條件和規(guī)模。首先應(yīng)提出全年銷售目標(biāo)，再根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)中各個(gè)環(huán)節(jié)的消耗，制定出相應(yīng)的全年生產(chǎn)計(jì)劃，一般生產(chǎn)數(shù)量應(yīng)比計(jì)劃銷售的數(shù)量增加20％～30％。

50第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)（2）生產(chǎn)計(jì)劃的實(shí)施

生產(chǎn)計(jì)劃實(shí)施的步驟為：①準(zhǔn)備繁殖材料。②合格繁殖材料的快速增殖。存瓶增殖總瓶數(shù)＝月計(jì)劃生產(chǎn)苗數(shù)／每個(gè)增殖瓶月可產(chǎn)苗數(shù)

月計(jì)劃生產(chǎn)苗數(shù)＝每個(gè)操作人員每天可接苗數(shù)×月工作日×人員數(shù)控制試管苗生產(chǎn)中的增殖總瓶數(shù)，便于在一個(gè)周期內(nèi)全部更新一次培養(yǎng)基，使增殖材料處于不同生長(zhǎng)階段的最佳狀態(tài)，提高其質(zhì)量。51第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)

3.產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)控如接種狀況、污染率、生長(zhǎng)情況、生根苗數(shù)量、出瓶苗質(zhì)量等，并建立試管苗出瓶標(biāo)準(zhǔn)。52第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)4.商業(yè)化生產(chǎn)效益分析

通過(guò)成本核算可以了解：①生產(chǎn)過(guò)程中的各種消耗；②管理工作的質(zhì)量；③各項(xiàng)技術(shù)措施的效果；④產(chǎn)品價(jià)格的制定標(biāo)準(zhǔn)。53第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)

試管苗商業(yè)化的生產(chǎn)成本應(yīng)包括：①人工費(fèi)用。②生產(chǎn)物資費(fèi)用。③設(shè)備折舊費(fèi)用。④水電費(fèi)用。⑤其他費(fèi)用。54第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)三、降低商業(yè)化生產(chǎn)成本的措施針對(duì)試管苗生產(chǎn)所需的費(fèi)用，應(yīng)采取相應(yīng)措施降低生產(chǎn)成本，增強(qiáng)產(chǎn)品競(jìng)爭(zhēng)力，提高試管苗經(jīng)濟(jì)效益。1.提高勞動(dòng)生產(chǎn)率2.減少設(shè)備投資，延長(zhǎng)使用壽命3.降低消耗4.降低污染，提高繁殖率和成活率5.簡(jiǎn)化培養(yǎng)基55第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)四、離體快繁商業(yè)性生產(chǎn)的范圍及應(yīng)用1．用于稀缺或急需良種植物的繁殖2．用于莖尖脫毒及無(wú)病毒苗木試管快速繁殖3．用于自然界無(wú)法用種子繁殖或難以保持后代一致的三倍體、單倍體及基因工程植株的快速繁殖4．瀕臨植物的拯救5．用于種質(zhì)的試管保存及交換56第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)蘭科植物生產(chǎn)57第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)無(wú)菌苗快速繁殖58第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)無(wú)菌苗馴化59第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)60第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)五、商業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)注意的問(wèn)題（一）污染

61第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)1.污染概念：在組培過(guò)程中培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料滋生雜菌，導(dǎo)致培養(yǎng)失敗的現(xiàn)象。2.污染原因：細(xì)菌、真菌為病源菌；污染途徑有外植體帶菌，培養(yǎng)基及器皿滅菌不徹底，操作人員未遵守操作規(guī)程，環(huán)境不清潔。第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)（1）真菌污染的特點(diǎn)：污染部分長(zhǎng)有不同顏色的霉菌，在接種后3～10天才能發(fā)現(xiàn)。（真菌菌落大，顏色多樣，表面呈毛絨狀，嗅之一般有霉味，真菌會(huì)產(chǎn)生菌絲）原因：周圍環(huán)境不清潔超凈工作臺(tái)的過(guò)濾裝置失效培養(yǎng)用器皿的口徑過(guò)大等為了減少損失，提高工作效率，必須在每個(gè)操作環(huán)節(jié)注意防止污染的發(fā)生。

3.污染特點(diǎn)第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)（2）細(xì)菌污染的特點(diǎn)：菌斑呈粘液狀物，而且在接種后1～2天即可發(fā)現(xiàn)。（細(xì)菌菌落小，表面呈乳脂狀光澤，嗅之一般有酸臭味，細(xì)菌污染沒(méi)有菌絲）原因：材料帶菌培養(yǎng)基滅菌不徹底操作人員未遵守操作規(guī)程因此接種人員的手應(yīng)經(jīng)常用70%灑精擦凈，鑷子和接種針在使用前必須在火焰上燒紅。第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)4.預(yù)防措施（1）防止材料帶菌：避免陰雨天在室外采集外植體；材料預(yù)培養(yǎng)。（2）嚴(yán)格外植體滅菌（3）接種用具滅菌徹底（4）嚴(yán)守?zé)o菌操作規(guī)程（5）保持培養(yǎng)室清潔（6）做好超凈工作臺(tái)檢修、養(yǎng)護(hù)第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)防止材料帶菌的措施（1）用莖尖作外植體時(shí)，可在室內(nèi)或無(wú)菌條件下對(duì)枝條先進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。

枝條→水洗凈→插入無(wú)糖的營(yíng)養(yǎng)液或自來(lái)水抽枝，以這種新抽的嫩枝條作為外植體接種。這樣便可大大減少材料的污染。在無(wú)菌條件下對(duì)采自田間的枝條進(jìn)行暗培養(yǎng)，待抽出徒長(zhǎng)的黃化枝條時(shí)采枝，經(jīng)滅菌后接種也可明顯減少污染。第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)（2）多次滅菌法：如咖啡成熟葉片的滅菌即用這種方法。首先除去主脈（因主脈與支脈交界處常有真菌休眠孢子存在），同時(shí)去掉葉的頂端、基部和邊緣部分，這樣可大大減少污染；其次，將切好的外植體放入1.3%的次氯酸鹽溶液中（商品漂白粉25%的溶液），滅菌30min；第三，在無(wú)菌蒸餾水中沖洗3次；第四，將材料封閉在無(wú)菌的培養(yǎng)皿中過(guò)夜，保持一定溫度；第五，次日將葉片用2.6%次氯酸鈉滅菌30min，然后，用蒸餾水洗3次。對(duì)層積過(guò)的種子也可用多次滅菌法，在種子吸脹前后都要滅菌，在層積貯藏的第一周還應(yīng)增加1次滅菌處理。第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)（3）多種藥液交替浸泡法對(duì)容易污染而難滅菌的材料：1.取莖尖、芽或器官外植體，用自來(lái)水及肥皂充分洗凈，表面不可附著污垢、灰塵，用剪刀修剪掉外植體上無(wú)用的部分，剝?nèi)パ可削[片；2.將材料放入70%—75%醫(yī)用灑精中滅菌數(shù)秒鐘；3.1：500RoccalB（一種商品滅菌劑名）稀釋液中浸5min4.放入5%—10%次氯酸鈉溶液中并滴入“吐溫80”數(shù)滴，滅菌15—30min，或浸入0.1%—0.2%升汞溶液中并加入“吐溫80”數(shù)滴，滅菌5—10min；5.用無(wú)菌水沖洗5次。也可以在從次氯酸鈉溶液中取出后，再放入無(wú)菌的0.1mol鹽酸（HCl）中浸片刻，再用無(wú)菌水沖洗數(shù)次。第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)5.組培苗污染的處理（1）發(fā)現(xiàn)污染的材料應(yīng)及時(shí)處理，否則將導(dǎo)致培養(yǎng)室環(huán)境污染。（2）對(duì)一些特別寶貴的材料，可以取出再次進(jìn)行更為嚴(yán)格的滅菌，然后接入新鮮的培養(yǎng)基中重新培養(yǎng)。（3）要處理的污染培養(yǎng)瓶最好在打開(kāi)瓶蓋前，先集中進(jìn)行高壓滅菌，再清除污染物，然后洗凈備用后的處理第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)（二）褐變1.褐變的概念是指外植體在培養(yǎng)過(guò)程，自身組織從表面向培養(yǎng)基釋放出褐色物質(zhì)，以致培養(yǎng)基逐漸變成褐色，外植體也隨之進(jìn)一步變褐而死亡的現(xiàn)象。2.褐變?cè)?/p>

木質(zhì)素→→→→醌→積累造成毒害。多酚氧化酶[O]第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)3.影響褐變的因素（1）植物品種（基因型）木>草（2）生理狀態(tài)材料年齡：幼齡期＜成年型材料大?。盒〔牧希即蟛牧辖M織：細(xì)嫩組織＜老熟組織

（3）培養(yǎng)基成分

無(wú)機(jī)鹽濃度過(guò)高、CTK水平過(guò)高外植體在最適宜的脫分化條件下，細(xì)胞大量增殖，抑制褐變。液體培養(yǎng)不容易褐變。PH高容易褐變。（4）培養(yǎng)條件

光照過(guò)強(qiáng)，溫度過(guò)高，培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，加速褐變。

（5）材料轉(zhuǎn)移時(shí)間長(zhǎng)>短

第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)4.褐變的防止措施（1）選擇適宜的外植體（2）選擇合適的培養(yǎng)條件（3）外植體預(yù)處理（還原劑浸泡）（4）加快繼代轉(zhuǎn)接的速度（5）加抗氧化劑（VC、PVP、牛血清、牛蛋白）（6）0.1－0.5%活性炭第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)（三）玻璃化1.概念玻璃化是試管苗的一種生理失調(diào)癥，在植物材料進(jìn)行離體培養(yǎng)時(shí)，有些培養(yǎng)物的嫩莖或葉片呈現(xiàn)半透明或水漬狀的現(xiàn)象。形態(tài)：植株矮小，節(jié)間短，葉水漬狀、半透明、脆易碎。第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)2.原因：（1）激素濃度（尤其CTK）增加或CTK╱IAA高（2）瓊脂濃度低（3）光照時(shí)間大于15h（4）溫度低，濕度大（5）通風(fēng)條件不好（6）培養(yǎng)基離子種類及比例不適宜第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)3.預(yù)防措施：（1）適當(dāng)控制培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽成分，適當(dāng)提高蔗糖和瓊脂濃度，減少含氮化合物的用量，降低培養(yǎng)基的水勢(shì)。（2）適當(dāng)降低CTK和GA的濃度?？紤]加入適當(dāng)?shù)拿撀渌?。?）增加自然光照，控制光照時(shí)間；增加容器通氣，控制溫度。（4）加入其他物質(zhì)（如活性炭、多效唑、間苯三本分、根皮苷）。第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)（四）組培其它常見(jiàn)問(wèn)題1.材料死亡2.黃化3.變異和畸形4.增殖率低下或過(guò)盛5.組培苗瘦弱或徒長(zhǎng)6.不生根或生根率低7.過(guò)渡苗死亡率高第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)1.材料死亡原因與預(yù)防外植體滅菌過(guò)度滅菌濃度和時(shí)間適宜污染注意環(huán)境和個(gè)人衛(wèi)生，嚴(yán)格操作培養(yǎng)基不適宜或配制有問(wèn)題選用合適培養(yǎng)基培養(yǎng)環(huán)境惡化改善培養(yǎng)環(huán)境，及時(shí)轉(zhuǎn)移和分瓶；加強(qiáng)組培苗的過(guò)渡管理第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)2.黃化（1）原因：培養(yǎng)基中Fe含量不足；礦物營(yíng)養(yǎng)不均衡；培養(yǎng)環(huán)境通氣不良，瓶?jī)?nèi)乙烯量高；激素配比不當(dāng)；光照不足；糖用量不足，長(zhǎng)期不轉(zhuǎn)移；培養(yǎng)溫