土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)公開(kāi)課

專題2:微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用課題2土壤中分解尿素的細(xì)菌的別離與計(jì)數(shù)1整理ppt課題背景1、尿素的利用尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥。尿素不能直接被農(nóng)作物吸收。土壤中的細(xì)菌將尿素分解成氨之后才能被植物利用。2、細(xì)菌能利用尿素的原因土壤中的細(xì)菌分解尿素是因?yàn)樗鼈兡芎铣呻迕窩O(NH2)2脲酶+H2O+CO22NH32整理ppt3、常見(jiàn)的分解尿素的微生物芽孢桿菌、小球菌、假單胞桿菌、克氏桿菌、棒狀桿菌、梭狀芽孢桿菌，某些真菌和放線菌也能分解尿素。4、課題目的①?gòu)耐寥乐袆e離出能夠分解尿素的細(xì)菌②統(tǒng)計(jì)每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細(xì)菌研究思路㈠.篩選菌株㈡.統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目㈢.設(shè)置對(duì)照3整理ppt1、實(shí)例：PCR技術(shù)啟示：尋找目的菌種時(shí)要根據(jù)它對(duì)生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找。原因：因?yàn)闊崛獪囟?0～800C，淘汰了絕大多數(shù)微生物只有Taq細(xì)菌被篩選出來(lái)。DNA多聚酶鏈?zhǔn)椒错懯且环N在體外將少量DNA大量復(fù)制(PCR)的技術(shù)，此項(xiàng)技術(shù)要求使用耐高溫〔930C〕的DNA聚合酶。㈠.篩選菌株4整理ppt要?jiǎng)e離一種微生物，必須根據(jù)該微生物的特點(diǎn)，包括營(yíng)養(yǎng)、生理、生長(zhǎng)條件等；方法：⑴抑制大多數(shù)微生物的生長(zhǎng)⑵促進(jìn)目的菌株的生長(zhǎng)結(jié)果：培養(yǎng)一定時(shí)間后，該菌數(shù)量上升，再通過(guò)平板稀釋等方法對(duì)它進(jìn)行純化培養(yǎng)別離。2、實(shí)驗(yàn)室中微生物的篩選原理：人為提供有利于目的菌株生長(zhǎng)的條件(包括營(yíng)養(yǎng)、溫度、pH等)，同時(shí)抑制或阻止其他微生物生長(zhǎng)。5整理ppt15.0g瓊脂1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO4`7H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO43、土壤中分解尿素的細(xì)菌的別離與計(jì)數(shù)所需培養(yǎng)基：①?gòu)奈锢硇再|(zhì)看此培養(yǎng)基屬于哪類？固體培養(yǎng)基6整理ppt②在此培養(yǎng)基中哪些作為碳源、氮源？碳源：葡萄糖氮源：尿素培養(yǎng)基的氮源為尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作為氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生長(zhǎng)發(fā)育繁殖，而受到抑制，所以用此培養(yǎng)基就能夠選擇出分解尿素的微生物。4、培養(yǎng)基選擇分解尿素的微生物的原理7整理ppt允許特定種類的微生物生長(zhǎng)，同時(shí)抑制或阻止其他種類微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，叫做選擇培養(yǎng)基8整理ppt5、怎樣證明此培養(yǎng)基具有選擇性呢？以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基

是別離尿素細(xì)菌判斷該培養(yǎng)基有無(wú)選擇性實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組培養(yǎng)基類型是否接種

目的

結(jié)果只生長(zhǎng)尿素細(xì)菌生長(zhǎng)多種微生物是9整理ppt1、顯微鏡直接計(jì)數(shù)：利用血球計(jì)數(shù)板(血細(xì)胞計(jì)數(shù)板〕，在顯微鏡下計(jì)算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。㈡.統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目：不能區(qū)分死菌與活菌；不適于對(duì)運(yùn)動(dòng)細(xì)菌的計(jì)數(shù)；需要相對(duì)高的細(xì)菌濃度；個(gè)體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察；缺點(diǎn)：10整理ppt2.間接計(jì)數(shù)法〔活菌計(jì)數(shù)法〕⑴原理：在稀釋度足夠高時(shí)，微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的一個(gè)菌落是由一個(gè)單細(xì)胞繁殖而成的，即一個(gè)菌落代表原先的一個(gè)單細(xì)胞。⑵常用方法：稀釋涂布平板法。每克樣品中的菌落數(shù)＝(C÷V)×M其中，C代表某一稀釋度下平板上生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積(ml)，M代表稀釋倍數(shù)。11整理ppt？說(shuō)明設(shè)置重復(fù)組的重要性。在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)，一定要涂布至少3個(gè)平板，作為重復(fù)組，才能增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)的說(shuō)服力與準(zhǔn)確性。在分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)，一定要考慮所設(shè)置的重復(fù)組的結(jié)果是否一致，結(jié)果不一致，意味著操作有誤，需要重新實(shí)驗(yàn)。12整理ppt本卷須知①為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在30——300的平板上進(jìn)行計(jì)數(shù)。②為使結(jié)果接近真實(shí)值可將同一稀釋度加到三個(gè)或三個(gè)以上的平板中，經(jīng)涂布，培養(yǎng)計(jì)算出菌落平均數(shù)。③統(tǒng)計(jì)的菌落往往比活菌的實(shí)際數(shù)目低。13整理ppt實(shí)例：在做分解尿素的細(xì)菌的篩選與統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的實(shí)驗(yàn)時(shí)，A同學(xué)從對(duì)應(yīng)的106倍稀釋的培養(yǎng)基中篩選出大約150個(gè)菌落，但是其他同學(xué)在同樣的稀釋度下只選擇出大約50個(gè)菌落。分析其原因。⑴土樣不同⑵培養(yǎng)基污染或操作失誤(或者是混入了其他的含氮物質(zhì))小結(jié)：通過(guò)這個(gè)事例可以看出，實(shí)驗(yàn)結(jié)果要有說(shuō)服力，對(duì)照的設(shè)置是必不可少的。假設(shè)一：由其他同學(xué)用與A同學(xué)相同土樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn)假設(shè)二：將A同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，作為空白對(duì)照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。結(jié)果預(yù)測(cè)：如果結(jié)果與A同學(xué)一致，那么證明A無(wú)誤；如果結(jié)果不同，那么證明A同學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問(wèn)題。如何驗(yàn)證?14整理ppt〔三〕設(shè)置對(duì)照①判斷培養(yǎng)基中是否有雜菌污染：將未接種的培養(yǎng)基同時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)。②判斷選擇培養(yǎng)基是否具有篩選作用：完全培養(yǎng)基〔營(yíng)養(yǎng)成分齊全〕接種后培養(yǎng)觀察菌落數(shù)目。

主要目的是排除實(shí)驗(yàn)組中非測(cè)試因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。15整理ppt從肥沃、酸堿度接近中性的濕潤(rùn)土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中?！拔⑸锏奶烊慌囵B(yǎng)基〞[一]土壤取樣數(shù)量最大、種類最多大約70%—90%是細(xì)菌◆取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌。16整理ppt[二]制備培養(yǎng)基

由于初次實(shí)驗(yàn)，對(duì)于稀釋的范圍沒(méi)有把握，因此選擇了一個(gè)較為寬泛的范圍：稀釋倍數(shù)為103～107。

可準(zhǔn)備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基。每個(gè)稀釋度下需要3個(gè)選擇培養(yǎng)基，1個(gè)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。

將稀釋相同倍數(shù)的菌液，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落數(shù)目應(yīng)明顯多于選擇培養(yǎng)基上的數(shù)目，因此，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基可以作為對(duì)照，用來(lái)判斷選擇培養(yǎng)基是否起到了選擇作用。17整理ppt◆應(yīng)在火焰旁稱取土壤10g?！粼谙♂屚寥廊芤旱倪^(guò)程中，每一步都要在火焰旁進(jìn)行◆別離不同的微生物采用不同的稀釋度原因：不同微生物在土壤中含量不同目的：保證獲得菌落數(shù)在30～300之間、適于計(jì)數(shù)的平板〔三〕 樣品的稀釋18整理ppt問(wèn)題：為什么別離不同的微生物要采用不同的稀釋度？測(cè)定土壤中細(xì)菌的總量和測(cè)定土壤中能分解尿素的細(xì)菌的數(shù)量，選用的稀釋范圍相同嗎？原因：土壤中各類微生物的數(shù)量〔單位：株/kg〕是不同的。例如在干旱土壤中的上層樣本中：好氧及兼性厭氧細(xì)菌數(shù)約為2185萬(wàn)，放線菌數(shù)約為477萬(wàn)，霉菌數(shù)約為23.1萬(wàn)。結(jié)論：為獲得不同類型的微生物，就需要按不同的稀釋度進(jìn)行別離，同時(shí)還應(yīng)當(dāng)有針對(duì)性地提供選擇培養(yǎng)的條件。19整理ppt㈣.取樣涂布◆實(shí)驗(yàn)時(shí)要對(duì)培養(yǎng)皿作好標(biāo)記。注明培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)時(shí)間、稀釋度、培養(yǎng)物等?！羧绻玫搅酥辽?個(gè)菌落數(shù)目在30——300的平板，那么說(shuō)明稀釋操作比較成功，并能夠進(jìn)行菌落的計(jì)數(shù)，如果同一稀釋倍數(shù)的三個(gè)重復(fù)的菌落數(shù)相差較大，說(shuō)明試驗(yàn)不精確，需要重新實(shí)驗(yàn)。20整理ppt㈤.微生物的培養(yǎng)與觀察在菌落計(jì)數(shù)時(shí)，每隔24h統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目。選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)的記錄作為結(jié)果，以防止因培養(yǎng)時(shí)間缺乏而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。培養(yǎng)不同微生物往往需要不同培養(yǎng)溫度。細(xì)菌：30～37℃培養(yǎng)1～2d

放線菌：25～28℃培養(yǎng)5～7d

霉菌：25～28℃的溫度下培養(yǎng)3～4d。21整理ppt微生物的培養(yǎng)與觀察菌落的形狀、大小、隆起程度和顏色22整理ppt23整理ppt操作提示[一]無(wú)菌操作1、取土用的小鐵鏟的盛土樣的信封在使用前都需要滅菌。2、應(yīng)在火焰旁稱取土壤。在火焰附近將稱好的土樣倒入錐形瓶中，塞好棉塞。3、在稀釋土壤溶液的過(guò)程中，每一步都要在火焰旁操作。[二]做好標(biāo)記注明培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)日期、平板培養(yǎng)樣品的稀釋度等。[三]規(guī)劃時(shí)間

三、24整理ppt四、課題成果與評(píng)價(jià)

培養(yǎng)物中是否有雜菌污染以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落

對(duì)照的培養(yǎng)皿在培養(yǎng)過(guò)程中沒(méi)有菌落生長(zhǎng)，說(shuō)明培養(yǎng)基沒(méi)有被雜菌污染。牛肉膏培養(yǎng)基的菌落數(shù)目明顯大于選擇培養(yǎng)基的數(shù)目，說(shuō)明選擇培養(yǎng)基已篩選出一些菌落。25整理ppt1.在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中參加酚紅指示劑。培養(yǎng)某種細(xì)菌后，如果PH升高，指示劑將變紅，說(shuō)明該細(xì)菌能夠分解尿素。五.課外延伸CO〔NH2〕2+H