抗麻痹性貝毒x2,3單克隆抗體的制備

抗麻痹性貝毒x2,3單克隆抗體的制備

麻痹性苦貝毒是一種低劑量、高毒性的苦貝毒素，主要由a.a.kana、a.aciela、a.cohora、a.felius、a.nimosum、a.gonama、a.gynodimi、a.nimosum、a.gonama、a.pirrizam和其他淡水綠藻組成。它通過影響鈉離子通道來抑制神經(jīng)的傳導(dǎo)，是一種神圣的微沙。膝溝藻毒素(gonyautoxin,GTX)(GTX2,3的分子結(jié)構(gòu)見圖1)為麻痹性貝類毒素家族中重要的成員,是一類含雙胍基的三環(huán)生物堿化合物,呈堿性,易溶于水,在弱酸和低溫條件下比較穩(wěn)定。調(diào)查顯示我國南北海區(qū)均存在可產(chǎn)生麻痹性貝毒的赤潮藻,且在多個采樣點發(fā)現(xiàn)了多種貝類含有麻痹性貝毒素,曾檢測出廣東大亞灣貝類養(yǎng)殖區(qū)麻痹性貝毒含量超過可食用閾值近30倍。自60年代以來,我國有1600人誤食染有毒素的貝類中毒,造成30人死亡。資料顯示,GTX2,3是我國南方沿海染毒貝類和有毒赤潮藻的麻痹性貝毒的主要成分之一?；榭臻g異構(gòu)體的GTX2和GTX3,由于相對分子量小(396.36Da)、毒性大,不具備完全抗原特性。其分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜,雖有較多官能團(tuán),但活性都不高。小鼠生物測試法是常用的檢測麻痹性貝毒的方法。但此種方法不能確知毒素的組成及含量,且重復(fù)性差,靈敏度不高。近幾年發(fā)展起來的HPLC法具有靈敏、高效的特點,但成本高,費時,需要較高的儀器設(shè)備及分析技術(shù)。酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)(ELISA)具有簡便、快速、靈敏、成本低廉等特點,是目前最有前途的檢測麻痹性貝毒技術(shù)。近十多年來,人們用多種方法試圖開發(fā)出用于不同生物毒素檢測的可靠的免疫診斷試劑盒。Johnson等1964年首次成功制備了抗STX的多克隆抗體,AdachiM等人嘗試用單克隆抗體技術(shù)現(xiàn)場監(jiān)測產(chǎn)麻痹性貝毒的有毒藻。近年有關(guān)麻痹性貝毒(特別是石房蛤毒素STX)的免疫學(xué)測定方法已取得了重大進(jìn)展,初步建立了麻痹性貝毒的放射免疫測定技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)(ELISA)。由于毒素純化不易、價格昂貴、偶聯(lián)難度大、免疫易造成動物中毒等原因,僅加拿大、日本等少數(shù)發(fā)達(dá)國家掌握了此技術(shù)。國內(nèi)劉潔生等曾嘗試用基因工程的方法,進(jìn)行重組質(zhì)粒HF443-EGFP的構(gòu)建和在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá),并進(jìn)行了其用于赤潮毒素檢測的可能性研究。本研究將GTX2,3與BSA偶聯(lián)制備完全抗原,通過運用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù),成功制備了抗GTX2,3的單克隆抗體,并分析了其抗原結(jié)合特異性和穩(wěn)定性。為建立快速、簡便的酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù),應(yīng)用于麻痹性貝毒素的快速鑒定和監(jiān)測建立了基礎(chǔ)。一旦建立ELISA檢測毒技術(shù)將對確保我國海產(chǎn)養(yǎng)殖健康發(fā)展和海產(chǎn)品的食用安全有積極意義。1材料和方法1.1absystems試驗1.1.3主要儀器設(shè)備酶標(biāo)儀,ThermoLabsystems;低溫冷凍離心機(jī),上海安亭儀器廠;CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱,ShellabTC2323;pH計,Cyberscan1000丹麥。1.2去除原代地文化并制備,制備并進(jìn)行酶制使用1.2.1完全抗原GTX2,3-BSA的制備參照文獻(xiàn)稱取0.0023gBSA溶于160μL0.01mol·L-1pH7.6的PBS中。取85μL2.37mg·mL-1GTX2,3加入上述所得BSA溶液中。再于混合液中加入適量甲醛,25℃反應(yīng)72h后轉(zhuǎn)入4℃冰箱反應(yīng)12h。收集反應(yīng)液于截流分子量為5000的超濾管中,10000rpm超濾離心除去未反應(yīng)的毒素、甲醛等小分子。超濾3次后取超濾外液0.5mL注射小鼠,5min后小鼠死亡,繼續(xù)超濾離心。超濾離心5次后,取超濾截留物及超濾外液分別注射小鼠,未見死亡。收集截留物溶于濃度為0.01mol·L-1pH7.6的PBS中,分裝,于-20℃冰箱中保存。1.2.2檢測抗原GTX2,3-KLH的制備稱取0.0020gKLH溶于160μL濃度為0.01mol·L-1pH7.6的PBS中,后續(xù)方法同1.2.1。1.2.3小鼠免疫及其血清效價的測定取制備所得GTX2,3-BSA偶聯(lián)物與弗氏完全佐劑等體積混合均勻。取0.3mL混合液(含100μgGTX2,3-BSA)皮下注射7周齡的BALB/c小鼠。之后每隔2周用弗氏不完全佐劑與GTX2,3-BSA混勻重復(fù)免疫。第3次免疫后8d試血,分別以1000ng·well-1,2000ng·well-1,4000ng·well-1自制檢測抗原GTX2,3-KLH包被酶標(biāo)板,以正常小鼠血清作為陰性對照,用間接ELISA法檢測抗體效價。細(xì)胞融合前3d加強(qiáng)免疫1次,共免疫5次。1.2.4間接ELISA將制備所得的檢測抗原GTX2,3-KLH溶于pH9.6包被緩沖液,包被于酶標(biāo)板,包被濃度為4000ng·well-1,4℃過夜。PBS-T洗滌后加入10%脫脂奶粉封閉,37℃濕盒溫育2h。PBS-T洗滌后,加入細(xì)胞培養(yǎng)上清或是系列稀釋的抗血清及腹水,37℃濕盒溫育1h。PBS-T洗滌,加入1∶1000稀釋的羊抗小鼠IgG-HRP,37℃濕盒溫育0.5h。PBS-T洗滌,加入OPD底物液顯色15min。用2mol·L-1H2SO4終止顯色反應(yīng),于492nm測定吸光值。1.2.5細(xì)胞融合將脾細(xì)胞與Sp2/0細(xì)胞按12.5:1的比例用PEG進(jìn)行融合。將融合細(xì)胞置于2塊預(yù)先培養(yǎng)有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。1.2.6陽性雜交瘤的篩選融合細(xì)胞于HAT培養(yǎng)基培養(yǎng)1周后,間接ELISA法檢測培養(yǎng)上清,陽性克隆用有限稀釋法克隆化,篩選可穩(wěn)定分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞。1.2.7單克隆抗體特異性分析以GTX2,3-KLH作為檢測抗原,4000ng·well-1包被BSA及GTX2,3-KLH,1:50免疫小鼠血清作為陽性對照,完全培養(yǎng)基作為陰性對照,用間接ELISA法檢測所得單克隆抗體與載體蛋白BSA的交叉反應(yīng)性。1.2.8腹水型單克隆抗體的制備用0.5mL弗氏不完全佐劑腹腔注射小鼠,24h后將106個雜交瘤細(xì)胞注入小鼠腹腔內(nèi)。同時以106數(shù)量的Sp2/0細(xì)胞注射小鼠制備腹水作為陰性對照。12d后開始收集腹水。2結(jié)果2.1elisa檢測以1000ng·well-1,2000ng·well-1,4000ng·well-1自制檢測抗原GTX2,3-KLH包被,正常小鼠血清作為陰性對照,間接ELISA檢測結(jié)果如圖2顯示:隨著包被抗原量的不同,免疫小鼠的血清有不同的反應(yīng)曲線。證明小鼠體內(nèi)產(chǎn)生抗GTX2,3的抗體,毒素與載體偶聯(lián)成功。基于上述結(jié)果加強(qiáng)免疫1次,8d后用間接ELISA法檢測到小鼠血清中抗體效價為3.2×10-3。2.2免疫小鼠血清中雜交瘤細(xì)胞的表達(dá)細(xì)胞融合10d后,96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中共有137孔出現(xiàn)細(xì)胞克隆,融合率為69.9%。用間接ELISA法對融合細(xì)胞進(jìn)行篩選。以1:50稀釋的免疫小鼠血清作為陽性對照,完全培養(yǎng)基作為陰性對照,獲得1株分泌抗GTX2,3抗體的雜交瘤細(xì)胞,陽性率為0.8%。將陽性孔的細(xì)胞經(jīng)過3次克隆化,陽性率分別為31.2%,88.9%和100%。篩選出F4、F10、G9共3株高特異性雜交瘤,經(jīng)3次傳代,3次凍存及復(fù)蘇,雜交瘤細(xì)胞分泌抗體穩(wěn)定。2.3elisa法檢測單克隆抗體與bsa的反應(yīng)以4000ng·well-1包被BSA及GTX2,3-KLH,如2.2設(shè)陽性、陰性對照,用間接ELISA法檢測所得單克隆抗體與BSA反應(yīng)結(jié)果如圖3。結(jié)果顯示單克隆抗體與BSA有不同程度的反應(yīng)。其中F4、F10、G9與GTX2,3-KLH結(jié)合力較強(qiáng),與BSA結(jié)合力較弱。2.4測定了腹部阻力的有效性以Sp2/0細(xì)胞制備腹水作為陰性對照,用間接ELISA法測定結(jié)果如圖4。F10單抗腹水效價為1.4×10-5。3u3000表達(dá)由于高純度的毒素制備困難,價格昂貴,將毒素與載體蛋白偶聯(lián)技術(shù)難度較大,故國內(nèi)相關(guān)研究較滯后。本研究利用不同方法將載體蛋白上的氨基和GTX2,3上的氨基聯(lián)接。根據(jù)文獻(xiàn)報道PSP毒素對鼠的最低致死量(MLD)為10μg·Kg-1,本實驗中偶聯(lián)產(chǎn)物GTX2,3-BSA需超慮除去未反應(yīng)的GTX2,3后免疫小鼠。而抗原的劑量太少不能有效刺激小鼠產(chǎn)生抗體,過多不僅會抑制抗體的產(chǎn)生,還可能因為半抗原的毒性導(dǎo)致小鼠死亡。故免疫劑量非常重要,經(jīng)摸索比較偶聯(lián)產(chǎn)物GTX2,3-BSA以每只100μg的劑量皮下免疫小鼠。實驗過程中發(fā)現(xiàn)檢測抗原GTX2,3-KLH放置時間越長反應(yīng)性變低,可能與GTX2,3結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性有關(guān)。因麻痹性貝毒素在酸性條件下穩(wěn)定,堿性條件下易發(fā)生氧化,毒性消失,而本實驗GTX2,3與載體蛋白的偶聯(lián)反應(yīng)需在偏堿環(huán)境中進(jìn)行,故pH值、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間都需嚴(yán)格控制。細(xì)胞融合后,間接ELISA法只篩選出1株陽性雜交瘤細(xì)胞,陽性率過低?？赡芘c小鼠免疫次數(shù)較少有關(guān)。因毒素量有限,在抗血清效價不高的情況下進(jìn)行融合,給陽性雜交瘤的篩選帶來了一定困難。實驗結(jié)果顯示單克隆抗體與GTX2,3-KLH結(jié)合力較強(qiáng),而與BSA存在不同程度的反應(yīng)。GTX2,3與BSA具有共同抗原表位的可能性較小,國外同類實驗制備的單克隆抗體也未提到與載體蛋白有交叉反應(yīng)。腹水抗體效價的檢測中發(fā)現(xiàn)間接ELISA法測得的吸光值不高,懷疑與包被抗原GTX2,3-KLH放置時間較長有關(guān)。因相關(guān)藻、貝類毒素暫時的缺乏,有關(guān)該實驗制得的單克隆抗體其它特性的分析將有待進(jìn)一步研究完善。1.1.1實驗動物7周齡雌性BALB/c小鼠(每只重約18～20g),購自中山大學(xué)實驗