實(shí)驗(yàn)二 雙水相萃取分離糖化酶

實(shí)驗(yàn)雙水相萃取分離糖化酶糖化酶

糖化酶，又稱葡萄糖淀粉酶，它能把淀粉從非還原性未端水解a-1.4葡萄糖苷鍵產(chǎn)生葡萄糖，也能緩慢水解a-1.6葡萄糖苷鍵，轉(zhuǎn)化為葡萄糖。同時(shí)也能水解糊精，糖原的非還原末端釋放β-D-葡萄糖。

糖化酶用于以葡萄糖作發(fā)酵培養(yǎng)基的各種抗生素、有機(jī)酸、氨基酸、維生素的發(fā)酵；本品還大量用于生產(chǎn)各種規(guī)格的葡萄糖?？傊?，凡對(duì)淀粉、糊精必需進(jìn)行酶水解的工業(yè)上，都可適用。雙水相體系就是考慮到這種現(xiàn)狀，基于液液萃取理論同時(shí)考慮保持生物活性所開發(fā)的一種新型的液液萃取分離技術(shù)。雙水相萃取1概述雙水相萃取技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)：作為一種新型的分離技術(shù)，克服了常規(guī)萃取有機(jī)溶劑對(duì)生物物質(zhì)的變性作用，提供了一個(gè)溫和的活性環(huán)境，在萃取過程中具有保持生物物質(zhì)的活性及構(gòu)象等明顯的技術(shù)優(yōu)勢(shì)。雙水相萃取技術(shù)缺點(diǎn)：易乳化、相分離時(shí)間長(zhǎng)，成相聚合物的成本較高，水溶性高聚物大多數(shù)黏度較大，不易定量控制；水溶性的高聚物難以揮發(fā)，使反萃必不可少，高聚物回收困難等。2雙水相體系2.1雙水相的形成機(jī)理2.1.1概念某些有機(jī)物之間或有機(jī)物與無機(jī)鹽之間，在水中以適當(dāng)?shù)臐舛热芙夂笮纬苫ゲ幌嗳艿膬上嗷蚨嘞嗨囿w系，兩相中水的含量都很高，如下圖：由聚乙二醇6000與葡聚糖兩種混合物形成的雙水相體系示意圖：2雙水相體系雙水相形成的依據(jù)特征：把兩種具有一定濃度的親水性聚合物溶液混合后靜置，兩種高聚物分子間有斥力，某種分子希望它周圍的分子是同種分子而非異種分子，這些親水性的高分子聚合物并不混為一相，而是分成兩個(gè)液相，這種現(xiàn)象稱之為聚合物的不相容性。但對(duì)近幾年開發(fā)研究的高聚物與鹽、低分子量的某些表面活性劑，這樣解釋就顯得無能為力，有待于進(jìn)一步探索。2.2相圖橫坐標(biāo)為葡聚糖的含量，縱坐標(biāo)為聚乙二醇的含量，把均勻區(qū)和兩相區(qū)分開的曲線稱雙節(jié)線，雙節(jié)線下方的區(qū)域，高聚物均勻溶于水而不分相，上方的區(qū)域分為兩相，上相聚集了PEG，下相是高聚物葡聚糖。2.2相圖用A點(diǎn)代表體系總組成，B點(diǎn)和C點(diǎn)分別代表互相平衡的上相和下相組成，稱為節(jié)點(diǎn)。A、B、C三點(diǎn)在一條直線上，稱為系線。系線的長(zhǎng)度是衡量?jī)上嚅g相對(duì)差別的尺度，系線越長(zhǎng)，兩相間的性質(zhì)差別越大，反之則越小。若A向雙節(jié)線移動(dòng)，B、C兩點(diǎn)接近，系線長(zhǎng)度趨向于零時(shí)，即A點(diǎn)在雙節(jié)線K點(diǎn)時(shí)，體系變成一相，K稱為臨界點(diǎn)。在同一系線上不同的點(diǎn)，總組成不同，而上、下兩相組成相同，只是兩相體積VT、VB不同。2.3常用的雙水相體系常用體系

雙水相萃取中常采用的雙聚合物系統(tǒng)為PEG/Dex，該雙水相的上相富含PEG，下相富含Dex。

3雙水相萃取原理3.1雙水相萃取的基本原理雙水相萃般與水-有機(jī)相萃取的原理相似，都是依據(jù)物質(zhì)在兩相間的選擇性分配，但萃取體系的性質(zhì)不同。

當(dāng)物質(zhì)進(jìn)入雙水相體系后，由于表面性質(zhì)、電荷作用和各種力(如憎水鍵、氫鍵和離子鍵等)的存在和環(huán)境因素的影響，在上相和下相間進(jìn)行選擇性分配，這種分配關(guān)系與常規(guī)的萃取分配關(guān)系相比，表現(xiàn)出更大或更小的分配系數(shù)。其分配規(guī)律服從Nernst分配定律

CT、CB分別代表上相、下相中的溶質(zhì)的濃度。研究表明，在相體系固定時(shí)，預(yù)分離物質(zhì)在相當(dāng)大的濃度范圍內(nèi)，分配系數(shù)K為常數(shù)，與溶質(zhì)的濃度無關(guān)，只取決于被分離物質(zhì)本身的性質(zhì)和特定的雙水相體系。3.2影響物質(zhì)分配平衡的因素

影響物質(zhì)在雙水相系統(tǒng)巾分配的主要因素有：組成雙水相體系的高聚物類型；高聚物的平均分子量和分子量分布；高聚物的濃度；成相鹽和非成相鹽的種類；鹽的離子強(qiáng)度；pH值。(1)高聚物的分子量在高聚物濃度保持不變的前提下，降低該高聚物的分子量，被分配的可溶性生物大分子如蛋白質(zhì)或核酸，將更多的分配于該相。對(duì)PEG–Dcxtran體系而言，Dextran分子量減小，分配系數(shù)會(huì)減??；PEG的分于量減小，物質(zhì)的分配系數(shù)會(huì)增大(見表2-13)，這是一條普遍規(guī)律。(2)高聚物濃度—界面張力的影響

當(dāng)成相系統(tǒng)的總濃度增大時(shí)，系統(tǒng)遠(yuǎn)離臨界點(diǎn)，系線長(zhǎng)度增加，兩相性質(zhì)的差別(疏水性等)增大，蛋白質(zhì)越容易分配到其中的一相。(3)鹽類

由于鹽的正、負(fù)離子在兩相間的分配系數(shù)不同，兩相間形成電勢(shì)差，從而影響帶電生物大分子的分配。如下圖：加入氯化鈉對(duì)卵蛋白和溶菌酶分配系數(shù)的影響研究還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)鹽類濃度增加到一定程度，由于鹽析作用蛋白質(zhì)易分配于上相。分配系數(shù)幾乎隨鹽濃度成指數(shù)增加，且不同的蛋白質(zhì)增大程度各異。利用此性質(zhì)可使蛋白質(zhì)相互分離。KCl對(duì)分配的影響與NacI類似。(4)pH值

pH值對(duì)分配的影響源于兩個(gè)方面的原因。第一，pH值會(huì)影響蛋白質(zhì)分子所帶電荷的性質(zhì)和數(shù)量。第二，pH值影響磷酸鹽的離解程度，從而改變H2PO4-和HPO42-之間的比例，進(jìn)而影響相間電位差。這樣蛋白質(zhì)的分配因pH值的變化發(fā)生變化。pH值的微小變化會(huì)使蛋白質(zhì)的分配系數(shù)政變2～3個(gè)數(shù)量級(jí)。加入的鹽不同，PH值的影響也不同(5)溫度

溫度影響雙水相系統(tǒng)的相圖，從而影響蛋白質(zhì)的分配系數(shù)。溫度越高發(fā)生相分離所需的高聚物濃度越高。在臨界點(diǎn)附近對(duì)雙水相體系形成的影響更為明顯。但一般來說，當(dāng)雙水相系統(tǒng)離雙節(jié)線足夠遠(yuǎn)時(shí)，1～2℃的溫度改變不影響目標(biāo)產(chǎn)物的萃取分離。由于高聚物對(duì)生物活性物質(zhì)有穩(wěn)定作用，在大規(guī)模生產(chǎn)中多采用常溫操作，從而節(jié)省冷凍費(fèi)用。但適當(dāng)提高操作溫度，體系黏度較低，有利于分離。3.3雙水相萃取過程

雙水相萃取過程包括以下幾個(gè)步驟：雙水相的形成；溶質(zhì)在雙水相中的分配；雙水相的分離。3.3雙水相萃取過程

在實(shí)際操作中，經(jīng)常將固狀(或濃縮的)聚合物和鹽直接加入到細(xì)胞勻漿液中，同時(shí)進(jìn)行機(jī)械攪拌使成相物質(zhì)溶解，形成雙水相。溶質(zhì)在兩相中發(fā)生物質(zhì)傳遞，達(dá)到分配平衡。

聚合物和鹽的溶解多為萃取過程的速率控制步驟。達(dá)到分配平衡后的兩相分離可采用重力沉降(靜置分層)或離心沉降法。3.4雙水相萃取的特點(diǎn)

雙水相萃取對(duì)于生物物質(zhì)的分離和純化表現(xiàn)出特有的優(yōu)點(diǎn)和獨(dú)有的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，具體表現(xiàn)在以下方面：①易于放大。各種參數(shù)可以按比例放大而產(chǎn)物收率并不降低。②雙水相系統(tǒng)之間的傳質(zhì)和平衡過程速度快，回收效率高，能耗較小，速度快。如選擇適當(dāng)體系，同收率可達(dá)80％以上，提純倍數(shù)可達(dá)2～20倍。③易于進(jìn)行連續(xù)化操作，設(shè)備簡(jiǎn)單，且可直接與后續(xù)提純工序相連接，無需進(jìn)行特殊處理。④雙水相體系的相間表而張力大大低于有機(jī)溶劑與水相之間的相間張力，相分離條件溫和，因而會(huì)保持絕大部分生物分子的活性，可直接用在發(fā)酵液中。⑤影響雙水相體系的因素比較復(fù)雜，可以采取多種手段來提高選擇性或提高收率。⑥操作條件溫和，整個(gè)操作過程在常溫常壓下進(jìn)行。⑦不存在有機(jī)溶劑殘留問題，高聚物一般是不揮發(fā)性物質(zhì)，因而操作環(huán)境對(duì)人體無害。⑧親和雙水相萃取技術(shù)可以提高分配系數(shù)和萃取的專一性。3.4雙水相萃取的應(yīng)用生物工程技術(shù)中物質(zhì)的提取與純化中草藥有效成分的提取雙水相萃取分析稀有金屬、貴金屬分離一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、了解雙水相萃取在生物活性物質(zhì)提取中的重要作用與意義，及其與傳統(tǒng)溶媒萃取技術(shù)的異同。2、加深對(duì)分配系數(shù)K、相比R、收率Y等基本概念的認(rèn)識(shí)及相圖的制作，掌握液液萃取中基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理雙水相萃取技術(shù)是分離純化蛋白質(zhì)混合物等生物大分子的有效方法。雙水相系統(tǒng)通常是由水溶性的兩種聚合物組成或一種水溶性聚合物與一種鹽組成，相對(duì)于傳統(tǒng)溶劑萃取來說，雙水相萃取的最大優(yōu)勢(shì)在于雙水相體系可為生物活性物質(zhì)提供一個(gè)溫和的活性環(huán)境，因而可在萃取過程中保持生物物質(zhì)的活性和構(gòu)象，而且雙水相技術(shù)具有處理量大、能耗低、易連續(xù)化操作和工程放大等優(yōu)點(diǎn)。

二、實(shí)驗(yàn)原理生物大分子在雙水相上相和下相的濃度比被定義為分配系數(shù)（K=Cb/Ct）。在雙水相系統(tǒng)中有許多因素影響分配系數(shù)，包括系統(tǒng)本身的因素如系統(tǒng)組成、聚合物分子量、聚合物濃度、鹽和離子強(qiáng)度、pH等，以及目標(biāo)產(chǎn)物的性質(zhì)如疏水作用、電荷、分子量等，通過大量實(shí)驗(yàn)研究可以獲得特定蛋白質(zhì)和生物大分子的最適宜分離的相系統(tǒng)和最優(yōu)分配的。二、實(shí)驗(yàn)原理本實(shí)驗(yàn)選用PEG400-(NH4)2SO4為雙水相系統(tǒng)，從發(fā)酵液中萃取糖化酶。收率相比式中:Cb、Ct分別為下、上相酶濃度（活性）；

Vb、Vt

分別為下相、上相的體積。物料衡算：加入的原液總酶活=上相酶活×上相體積+下相酶活×下相體積

三、實(shí)驗(yàn)儀器與藥品儀器：天平、恒溫水浴、離心機(jī)、液相混合器、刻度試管、吸管及酸式滴定管等藥品：糖化酶PEG400、(NH4)2SO4、2%可溶性淀粉、0.15mol/LNaOH、1mol/LH2SO4四、實(shí)驗(yàn)步驟：（一）PEG400-(NH4)2SO4雙水相系統(tǒng)相圖的制作

1.在具塞三角瓶中準(zhǔn)確稱量7g左右的PEG400,再加入5ml水（此時(shí)體系澄清）。

2.慢慢加入40％(NH4)2SO4溶液（已經(jīng)配好），不斷搖勻，直至試管開始出現(xiàn)混濁為止,記錄加入的(NH4)2SO4量；

四、實(shí)驗(yàn)步驟：3.再加入適量水（水的加量按實(shí)驗(yàn)記錄部分的表依次進(jìn)行）,使體系變澄清，并繼續(xù)加入40%(NH4)2SO4，使系統(tǒng)再次變混濁；次數(shù)水體積(ml)水的重量（g）40％硫酸銨溶液硫酸銨（非溶液）累計(jì)量（g）總?cè)芤后w系累計(jì)量（g）PEG含量％（g/g）硫酸銨含量％（g/g）gml154.941.261.110.50413.2953.353.79232.953.222.801.79219.4636.439.21333.018.226.925.0830.6923.1016.55432.9512.4110.4110.04446.0515.4021.81554.9724.6321.6019.89675.659.3726.30四、實(shí)驗(yàn)步驟：4.如此反復(fù)操作，計(jì)算達(dá)到混濁時(shí)PEG和(NH4)2SO4在系統(tǒng)中的重量百分濃度，得出PEG和(NH4)2SO4的雙節(jié)線圖。四、實(shí)驗(yàn)步驟：PEG400

0.700gH2O5ml(NH4)2SO4混和

H2O0.3/0.5ml渾濁記錄(NH4)2SO4ml數(shù)混均澄清旋渦器四、實(shí)驗(yàn)步驟：（二）雙水相系統(tǒng)中蛋白質(zhì)分配系數(shù)的測(cè)定1.用干燥的刻度試管稱取適量PEG400，再加入適量40%(NH4)2SO4溶液，加入適量水補(bǔ)足到30ml，在混合器上混勻，再加入1ml酶液，于混合器上混合2min。然后離心5min。2.取出讀取上、下相體積及總體積，按表二中所示的稀釋倍數(shù)取樣稀釋后，分別測(cè)其酶活。酶原液稀釋20倍測(cè)定。3.酶活測(cè)定方法見測(cè)得酶活性。四、實(shí)驗(yàn)步驟：編號(hào)PEG加入量（ml）40%硫酸銨加入量（ml）PEG含量硫酸銨含量PEG相（上相）水相（下相）相比分配系數(shù)收率%體積測(cè)得酶活稀釋倍數(shù)體積測(cè)得酶活稀釋倍數(shù)A3210.09680.27105.25663028.756310.18331.4285.18%B6210.19350.27101370102190.61977.7897.97%C911.250.29030.1452245310432.412.3396.73%D9210.29030.271016.55517.514.50.94337.9397.28%五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論：