乳腺生物反應(yīng)器

動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器

2023/12/91轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)加快家畜品種的改良速度，提高肉、奶、蛋的產(chǎn)量和品質(zhì)，生產(chǎn)珍貴的藥用蛋白,為大量患者造福。

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物最誘人的前景是作為生物反應(yīng)器，利用它生產(chǎn)人類所需要的生物活性產(chǎn)品或藥物，其常用方法是把目的基因在血液循環(huán)系統(tǒng)、唾液腺或乳腺等器官或組織中表達(dá)，從而獲得人類需要的目的產(chǎn)物。

根據(jù)目的蛋白表達(dá)部位的不同可分為乳腺生物反應(yīng)器、血液生物反應(yīng)器、卵生物反應(yīng)器、尿生物反應(yīng)器、精囊腺生物反應(yīng)器、唾液腺生物反應(yīng)器等。2023/12/92乳腺生物反應(yīng)器的原理及步驟乳腺生物反應(yīng)器的研究進(jìn)展乳腺生物反應(yīng)器的存在的問題乳腺生物反應(yīng)器的優(yōu)點(diǎn)及其應(yīng)用2023/12/93原理:

應(yīng)用重組DNA技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將目的基因轉(zhuǎn)移到尚處于原核階段的動(dòng)物胚胎中，經(jīng)胚胎移植得到轉(zhuǎn)基因乳腺表達(dá)多肽藥物、工業(yè)酶、疫苗和抗體等蛋白的技術(shù)。

外源基因在乳腺特異性表達(dá)需要乳蛋白基因的一個(gè)啟動(dòng)子和調(diào)控區(qū)，即需要一個(gè)引導(dǎo)泌乳期乳蛋白基因表達(dá)的序列，這樣才能將外源基因置于乳腺特異性調(diào)節(jié)序列控制之下，使其在乳腺中表達(dá)再通過回收奶獲得具有生物活性的目的蛋白。乳腺生物反應(yīng)器的原理及步驟2023/12/94步驟獲取目的基因構(gòu)建基因表達(dá)載體（在基因前加特異表達(dá)的啟動(dòng)子）顯微注射導(dǎo)入哺乳動(dòng)物受精卵中形成胚胎將胚胎送入母體動(dòng)物發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物（只有在產(chǎn)下的雌性動(dòng)物個(gè)體中，轉(zhuǎn)入的基因才能表達(dá)）2023/12/95轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)紅細(xì)胞生成素（EPO）將EPODNA分別以HindⅢ和BamHI酶切，回收5.4kb的HindⅢ/BamHI片段，插入pGEM-7zf(+)載體，再將867bp的BLG啟動(dòng)子插入EPO基因之前EcoR、ClaI位點(diǎn)，構(gòu)建表達(dá)載體pGEM-3zf(+)β-LG-EPO。通過顯微注射方法得到轉(zhuǎn)基因小鼠，其乳腺中的EPO含量可達(dá)0.5μg/ml。2023/12/9620世紀(jì)80年代末提出動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器的設(shè)想1987年，Gordon等首次報(bào)道在小鼠的乳腺中表達(dá)了人的組織纖溶酶原激活劑(tPA)基因。1991年，WrightG等培育成乳腺特異表達(dá)人抗胰蛋白酶轉(zhuǎn)基因綿羊，表達(dá)水平高達(dá)35g/L，在世界范圍內(nèi)引起了極大的轟動(dòng)。1991年，Brem等報(bào)道乳腺表達(dá)牛凝乳酶的轉(zhuǎn)基因兔，表達(dá)水平達(dá)到1～10g/L。1992年，Ve-lande：等報(bào)道了乳腺表達(dá)人C蛋白的轉(zhuǎn)基因豬，表達(dá)水平達(dá)到1g/L以上。

目前，從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳汁中提取的抗人胰蛋白酶、抗凝血酶Ⅲ和人C蛋白等基因工程產(chǎn)品已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，并已初步形成以轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺為主要生產(chǎn)手段的醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)。乳腺生物反應(yīng)器的研究進(jìn)展國(guó)外研究進(jìn)展2023/12/9720世紀(jì)80年代初，施履吉院士就提出乳腺生物反應(yīng)器的構(gòu)想，并成功獲得表達(dá)乙肝病毒表面抗原的轉(zhuǎn)基因兔，為我國(guó)通過轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的途徑獲得珍貴藥物奠定了基礎(chǔ)。1995年，我國(guó)首次在小鼠乳腺中成功地表達(dá)了人的基因；1996年10月上海醫(yī)學(xué)遺傳研究所與復(fù)旦大學(xué)合作研制成功的能在乳腺中表達(dá)人凝血因子Ⅳ的轉(zhuǎn)基因羊。2005年，國(guó)家“863”計(jì)劃組利用轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞克隆技術(shù)，分別獲得了轉(zhuǎn)人乳鐵蛋白、轉(zhuǎn)人溶菌酶、轉(zhuǎn)乳清白蛋白等轉(zhuǎn)人基因蛋白，其中人乳鐵蛋白和人α-乳清白蛋白是國(guó)際上首次利用轉(zhuǎn)基因克隆牛而獲得的。雖然我國(guó)在該項(xiàng)技術(shù)上取得了較大進(jìn)展，但還處于探索階段，與國(guó)外還有一定的差距。自國(guó)家“863”計(jì)劃對(duì)“動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器應(yīng)用研究”立項(xiàng)后，逐步受到有關(guān)部門和企業(yè)界的重視，研究和開發(fā)的力度加強(qiáng)，前景非常樂觀。國(guó)內(nèi)研究進(jìn)展2023/12/98表達(dá)產(chǎn)物能充分修飾且具有穩(wěn)定的生物活性

利用DNA重組技術(shù)的微生物來生產(chǎn)的藥用蛋白,由于細(xì)菌等微生物不能進(jìn)行蛋白質(zhì)合成后的加工,因而生物活性低,并且具有免疫原性。產(chǎn)品成本低,可以大規(guī)模生產(chǎn)藥物其效率是利用以大腸桿菌和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的100倍產(chǎn)品質(zhì)量高,易提純生物活性與天然蛋白幾乎完全一樣,極易提純。乳腺生物反應(yīng)器的優(yōu)點(diǎn)及其應(yīng)用2023/12/99應(yīng)用組織纖溶酶原激活劑(TPA)：由美國(guó)遺傳技術(shù)公司開發(fā)的血栓溶解劑，1987年11月經(jīng)聯(lián)邦食品及藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)上市。1988年的銷售額為1.5～1.6億美元，1989年為1.8～1.9億美元。今后每年的市場(chǎng)銷售額約為2～2.5億美元。重組人抗凝血酶ii:世界上第一個(gè)動(dòng)物乳腺生物反映器重組蛋白藥物。重組人抗凝血酶iii具有抑制血液中凝血酶活性，預(yù)防和治療急慢性血栓血塞形成，對(duì)治療抗凝血酶缺失癥有顯著效果。2010年，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)的重組蛋白產(chǎn)品銷售額達(dá)到350億美元，生產(chǎn)的藥物將占整個(gè)基因工程藥物種類的90%以上。2023/12/910目的基因在動(dòng)物基因中的整合問題由于目的基因在動(dòng)物基因中的整合是隨機(jī)的，因此包括整合位點(diǎn)、整合的拷貝數(shù)等機(jī)制還不清楚。所以易發(fā)生調(diào)節(jié)失控、遺傳不穩(wěn)定、表達(dá)率不高等問題。乳腺生物反應(yīng)器的存在的問題2023/12/911轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的成活率低在目的基因的分離和改造，乳腺特異表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因技術(shù)的關(guān)鍵性技術(shù)上存在缺陷，無(wú)法保證對(duì)基因的定點(diǎn)整合，因此轉(zhuǎn)基因動(dòng)物常會(huì)出現(xiàn)繁殖力下降、胚胎早期死亡等各種生理及病理缺陷。2023/12/912安全性動(dòng)物體內(nèi)雖然可以對(duì)外源蛋白進(jìn)行翻譯后修飾，但由于牛、羊等家畜存在自身機(jī)體保護(hù)系統(tǒng)可對(duì)所有外源性物質(zhì)產(chǎn)生排斥反應(yīng)，如出現(xiàn)蛋白質(zhì)水解等問題。此外乳汁中可能含有的微生物及不完全修飾的多肽都對(duì)產(chǎn)品的安全性構(gòu)成了極大的威脅，所以在分離