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文檔簡介
動物乳腺生物反應(yīng)器
2023/12/91轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)加快家畜品種的改良速度,提高肉、奶、蛋的產(chǎn)量和品質(zhì),生產(chǎn)珍貴的藥用蛋白,為大量患者造福。
轉(zhuǎn)基因動物最誘人的前景是作為生物反應(yīng)器,利用它生產(chǎn)人類所需要的生物活性產(chǎn)品或藥物,其常用方法是把目的基因在血液循環(huán)系統(tǒng)、唾液腺或乳腺等器官或組織中表達(dá),從而獲得人類需要的目的產(chǎn)物。
根據(jù)目的蛋白表達(dá)部位的不同可分為乳腺生物反應(yīng)器、血液生物反應(yīng)器、卵生物反應(yīng)器、尿生物反應(yīng)器、精囊腺生物反應(yīng)器、唾液腺生物反應(yīng)器等。2023/12/92乳腺生物反應(yīng)器的原理及步驟乳腺生物反應(yīng)器的研究進(jìn)展乳腺生物反應(yīng)器的存在的問題乳腺生物反應(yīng)器的優(yōu)點(diǎn)及其應(yīng)用2023/12/93原理:
應(yīng)用重組DNA技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù),將目的基因轉(zhuǎn)移到尚處于原核階段的動物胚胎中,經(jīng)胚胎移植得到轉(zhuǎn)基因乳腺表達(dá)多肽藥物、工業(yè)酶、疫苗和抗體等蛋白的技術(shù)。
外源基因在乳腺特異性表達(dá)需要乳蛋白基因的一個啟動子和調(diào)控區(qū),即需要一個引導(dǎo)泌乳期乳蛋白基因表達(dá)的序列,這樣才能將外源基因置于乳腺特異性調(diào)節(jié)序列控制之下,使其在乳腺中表達(dá)再通過回收奶獲得具有生物活性的目的蛋白。乳腺生物反應(yīng)器的原理及步驟2023/12/94步驟獲取目的基因構(gòu)建基因表達(dá)載體(在基因前加特異表達(dá)的啟動子)顯微注射導(dǎo)入哺乳動物受精卵中形成胚胎將胚胎送入母體動物發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動物(只有在產(chǎn)下的雌性動物個體中,轉(zhuǎn)入的基因才能表達(dá))2023/12/95轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)紅細(xì)胞生成素(EPO)將EPODNA分別以HindⅢ和BamHI酶切,回收5.4kb的HindⅢ/BamHI片段,插入pGEM-7zf(+)載體,再將867bp的BLG啟動子插入EPO基因之前EcoR、ClaI位點(diǎn),構(gòu)建表達(dá)載體pGEM-3zf(+)β-LG-EPO。通過顯微注射方法得到轉(zhuǎn)基因小鼠,其乳腺中的EPO含量可達(dá)0.5μg/ml。2023/12/9620世紀(jì)80年代末提出動物乳腺生物反應(yīng)器的設(shè)想1987年,Gordon等首次報(bào)道在小鼠的乳腺中表達(dá)了人的組織纖溶酶原激活劑(tPA)基因。1991年,WrightG等培育成乳腺特異表達(dá)人抗胰蛋白酶轉(zhuǎn)基因綿羊,表達(dá)水平高達(dá)35g/L,在世界范圍內(nèi)引起了極大的轟動。1991年,Brem等報(bào)道乳腺表達(dá)牛凝乳酶的轉(zhuǎn)基因兔,表達(dá)水平達(dá)到1~10g/L。1992年,Ve-lande:等報(bào)道了乳腺表達(dá)人C蛋白的轉(zhuǎn)基因豬,表達(dá)水平達(dá)到1g/L以上。
目前,從轉(zhuǎn)基因動物乳汁中提取的抗人胰蛋白酶、抗凝血酶Ⅲ和人C蛋白等基因工程產(chǎn)品已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段,并已初步形成以轉(zhuǎn)基因動物乳腺為主要生產(chǎn)手段的醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)。乳腺生物反應(yīng)器的研究進(jìn)展國外研究進(jìn)展2023/12/9720世紀(jì)80年代初,施履吉院士就提出乳腺生物反應(yīng)器的構(gòu)想,并成功獲得表達(dá)乙肝病毒表面抗原的轉(zhuǎn)基因兔,為我國通過轉(zhuǎn)基因動物的途徑獲得珍貴藥物奠定了基礎(chǔ)。1995年,我國首次在小鼠乳腺中成功地表達(dá)了人的基因;1996年10月上海醫(yī)學(xué)遺傳研究所與復(fù)旦大學(xué)合作研制成功的能在乳腺中表達(dá)人凝血因子Ⅳ的轉(zhuǎn)基因羊。2005年,國家“863”計(jì)劃組利用轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞克隆技術(shù),分別獲得了轉(zhuǎn)人乳鐵蛋白、轉(zhuǎn)人溶菌酶、轉(zhuǎn)乳清白蛋白等轉(zhuǎn)人基因蛋白,其中人乳鐵蛋白和人α-乳清白蛋白是國際上首次利用轉(zhuǎn)基因克隆牛而獲得的。雖然我國在該項(xiàng)技術(shù)上取得了較大進(jìn)展,但還處于探索階段,與國外還有一定的差距。自國家“863”計(jì)劃對“動物乳腺生物反應(yīng)器應(yīng)用研究”立項(xiàng)后,逐步受到有關(guān)部門和企業(yè)界的重視,研究和開發(fā)的力度加強(qiáng),前景非常樂觀。國內(nèi)研究進(jìn)展2023/12/98表達(dá)產(chǎn)物能充分修飾且具有穩(wěn)定的生物活性
利用DNA重組技術(shù)的微生物來生產(chǎn)的藥用蛋白,由于細(xì)菌等微生物不能進(jìn)行蛋白質(zhì)合成后的加工,因而生物活性低,并且具有免疫原性。產(chǎn)品成本低,可以大規(guī)模生產(chǎn)藥物其效率是利用以大腸桿菌和動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的100倍產(chǎn)品質(zhì)量高,易提純生物活性與天然蛋白幾乎完全一樣,極易提純。乳腺生物反應(yīng)器的優(yōu)點(diǎn)及其應(yīng)用2023/12/99應(yīng)用組織纖溶酶原激活劑(TPA):由美國遺傳技術(shù)公司開發(fā)的血栓溶解劑,1987年11月經(jīng)聯(lián)邦食品及藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)上市。1988年的銷售額為1.5~1.6億美元,1989年為1.8~1.9億美元。今后每年的市場銷售額約為2~2.5億美元。重組人抗凝血酶ii:世界上第一個動物乳腺生物反映器重組蛋白藥物。重組人抗凝血酶iii具有抑制血液中凝血酶活性,預(yù)防和治療急慢性血栓血塞形成,對治療抗凝血酶缺失癥有顯著效果。2010年,轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)的重組蛋白產(chǎn)品銷售額達(dá)到350億美元,生產(chǎn)的藥物將占整個基因工程藥物種類的90%以上。2023/12/910目的基因在動物基因中的整合問題由于目的基因在動物基因中的整合是隨機(jī)的,因此包括整合位點(diǎn)、整合的拷貝數(shù)等機(jī)制還不清楚。所以易發(fā)生調(diào)節(jié)失控、遺傳不穩(wěn)定、表達(dá)率不高等問題。乳腺生物反應(yīng)器的存在的問題2023/12/911轉(zhuǎn)基因動物的成活率低在目的基因的分離和改造,乳腺特異表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因技術(shù)的關(guān)鍵性技術(shù)上存在缺陷,無法保證對基因的定點(diǎn)整合,因此轉(zhuǎn)基因動物常會出現(xiàn)繁殖力下降、胚胎早期死亡等各種生理及病理缺陷。2023/12/912安全性動物體內(nèi)雖然可以對外源蛋白進(jìn)行翻譯后修飾,但由于牛、羊等家畜存在自身機(jī)體保護(hù)系統(tǒng)可對所有外源性物質(zhì)產(chǎn)生排斥反應(yīng),如出現(xiàn)蛋白質(zhì)水解等問題。此外乳汁中可能含有的微生物及不完全修飾的多肽都對產(chǎn)品的安全性構(gòu)成了極大的威脅,所以在分離
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