熒光素酶實驗-第三篇

雙熒光素酶報告基因檢測（三）螢火蟲熒光素酶片段互補成像（LCI）技術(shù)是一種新興的蛋白質(zhì)相互作用研究方法，其中兩個被研究的目標蛋白質(zhì)分別與螢火蟲熒光素酶的N端和C端相連。當(dāng)這兩個蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用時，熒光素酶的兩個段落會接近并組合成一個活性酶。結(jié)合煙草瞬時表達系統(tǒng)的LCI技術(shù)，能夠在植物細胞內(nèi)進行實時和定量的蛋白質(zhì)互作分析。這種方法不受植物自身熒光的干擾，操作簡便，無需細胞裂解或蛋白提取，有效地反映了植物在生理條件下蛋白質(zhì)的相互作用狀態(tài)。與其它蛋白質(zhì)互作研究技術(shù)相比,借助于煙草(Nicotianabenthamiana)瞬時表達系統(tǒng)的螢火素酶互補實驗(LCA)具有簡單、靈敏、可靠、高效和低背景等優(yōu)點,并可輕松擴展為大規(guī)模蛋白質(zhì)互作的篩選和驗證研究。螢火素酶互補實驗定性并定量分析生物發(fā)光或發(fā)光強度,從而檢測植物目標蛋白之間的相互作用。熒光素酶互補法(LCI)熒光素酶互補實驗（LCA）是將熒光素酶分為N端（NLuc）和C端（CLuc）兩個功能性片段。在此實驗中，兩個待研究的目標蛋白分別與NLuc和CLuc融合。當(dāng)這兩個目標蛋白發(fā)生相互作用時，它們將NLuc和CLuc拉近，使得熒光素酶的活性得以恢復(fù)，進而催化熒光素底物發(fā)光。由于其高靈敏度、定量化能力和簡便的操作流程。LCA技術(shù)已在植物和動物學(xué)的蛋白質(zhì)互作研究中得到廣泛應(yīng)用。在此技術(shù)的應(yīng)用中，螢火蟲熒光素酶的N端和C端片段只有在被分別融合到相互作用的蛋白質(zhì)上時才能恢復(fù)其活性，這一過程可以通過植物活體成像系統(tǒng)進行觀測。LCA技術(shù)適用于蛋白質(zhì)相互作用的瞬時表達或穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因表達研究。圖1利用熒光素酶互補實驗驗證植物蛋白互作原理實驗方法①分別將待測蛋白質(zhì)的基因克隆到含有CLuc和NLuc編碼序列的質(zhì)粒中，然后將所得質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中。②將含有這兩種質(zhì)粒的農(nóng)桿菌細菌浸入本氏煙草中，以便重組DNA可以被傳遞到植物細胞中并穩(wěn)定表達。③收集表達測試蛋白質(zhì)的葉組織，通過植物活體成像系統(tǒng)和高靈敏度發(fā)光檢測儀檢測生物發(fā)光的強度，從而對蛋白之間的相互作用進行定性和定量分析。最初開發(fā)用于檢測哺乳動物活細胞中的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，但后來被用于植物的研究中。借助于煙草的瞬時表達系統(tǒng)，將含有融合蛋白的表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后注射煙草葉片，培養(yǎng)2-3天后，在注射部位均勻涂抹反應(yīng)底物（熒火素）。通過植物活體成像系統(tǒng)(CCDimagingsystem)或高靈敏度發(fā)光檢測儀（luminometer）檢測生物發(fā)光的強度，從而對蛋白之間的相互作用進行定性和定量分析。此方法已被廣泛應(yīng)用于動植物相關(guān)領(lǐng)域的蛋白質(zhì)互作研究。優(yōu)/缺點優(yōu)點：①高度定量，允許在幾個數(shù)量級的范圍內(nèi)對發(fā)光信號進行線性測量。②與FRET和BiFC相比，此法可對整個組織或細胞群進行采樣，避免了來自單個細胞的偏差。③在黑暗中測量發(fā)光，不受葉綠素和細胞壁產(chǎn)生的自熒光的影響。④可用于在組織水平上研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，該技術(shù)對于研究組織特異性蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用非常有用。⑤無需顯微鏡，通過使用植物活體成像系統(tǒng)和板式發(fā)光檢測儀可以在1-2分鐘內(nèi)收集數(shù)據(jù)，進行定性和定量分析，同時檢測大量的蛋白質(zhì)組。⑥需要最少的樣品處理和實驗室培訓(xùn)，操作簡便，實驗高效。⑦LCI作為植物蛋白質(zhì)相互作用研究的簡單工具的可用性將有助于驗證從酵母雙雜交分析中收集的蛋白質(zhì)相互作用組數(shù)據(jù)。缺點：螢火蟲螢光素酶（Fluc）是SLC技術(shù)中最常用的螢光素酶，但Fluc的N端和C端片段體積過大，在某些情況下可能會干擾融合蛋白的功能或互作?？返律铮↘MDBioscience）(/)建立了完善的細胞培養(yǎng)平臺，能夠提供給客戶多種細胞學(xué)基礎(chǔ)實驗，可以提供優(yōu)質(zhì)的免疫檢測服務(wù)—雙熒光素酶標記基因檢測。我們通過以下兩個案例來進行分析：案例（一）蛋白質(zhì)OsXLG2-OsBIK1互作實例：參考文獻：LuciferaseComplementationAssayforDetectingProteinInteractions,DOI：10.1038/s41477-021-00951-9待檢測的2個目標蛋白OsXLG2和OsBIK1分別與NLuc和CLuc融合,如果2個目標蛋白相互作用,則螢火素酶的NLuc和CLuc在空間上會足夠靠近并正確組裝,從而發(fā)揮螢火素酶活性,即分解底物產(chǎn)生熒光。本實驗借助煙草(Nicotianabenthamiana)瞬時表達系統(tǒng),將含有融合蛋白的植物表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)后注射煙草葉片。24–48小時后,加入反應(yīng)底物螢火素,利用植物活體分子影像系統(tǒng)(CCDimagingsystem)或luminometer來定性定量檢測熒光強度,以判定目標蛋白之間OsXLG2和OsBIK1是否存在相互作用及互作的程度。圖1表達載體示意圖Fig.1pCAMBIA1300-NLuc(pNL);(B)pCAMBIA1300-CLuc(pCL)。構(gòu)建的表達載體中均包含pCAMBIA1300骨架,NLuc位于目標基因C末端,CLuc位于目標基因的N末端或C末端;序列中顯示的是單酶切位點。利用pNL和pCL中的酶切位點將目標基因與報告基因融合,獲得含有目標基因的重組質(zhì)粒。Fig.2將分別含有CLuc-OsXLG2和OsBIK1-NLuc質(zhì)粒的農(nóng)桿菌液1:1體積比混合后注射4周齡煙草葉片,24–48小時后進行檢測,以CLuc-OsPPI和OsBIK1-NLuc作為負對照(未發(fā)表)。(A)利用植物活體成像系統(tǒng)采集煙草葉片的發(fā)光圖像(Bar=2cm);(B)使用luminometer檢測螢火素酶活性,誤差表示平均值的標準偏差(n=8);(C)Westernblot檢測CLuc和NLuc融合蛋白的表達,融合蛋白分別用anti-luciferase和anti-CLuc抗體來檢測。（二）參考文獻：PhotoexcitedphytochromeBinteractswithBZR1torepressbrassinosteroidsignalinginArabidopsis,DOI：10.1111/jipb.12822該研究發(fā)現(xiàn)紅光受體phyB可以直接與BZR1轉(zhuǎn)錄因子物理互作并抑制BR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而抑制下胚軸伸長生長。植物光受體光敏色素B(phyB)介導(dǎo)植物的多種光反應(yīng)。在這項研究中，為了進一步闡明phyB調(diào)控下胚軸伸長的分子機制，作者進行了熒光素酶互補實驗(LCI)篩選與phyB相互作用的轉(zhuǎn)錄因子(TFs)。LCI分析表明，phyB與BZR1、BZR2、ARF6和WRKY36/54/70等轉(zhuǎn)錄因子呈現(xiàn)紅光依賴的物理互作。進一步生化分析表明，紅光激活的phyB特異性的與非磷酸化的BZR1相互作用，而非磷酸化的BZR1在BR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中是具有生理活性的，這種相互作用可以被光信號途徑負調(diào)控因子PIF4競爭性地干擾。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)phyB可以直接與BZR1的DNA結(jié)合域相互作用，從而影響B(tài)ZR1在靶基因染色質(zhì)上的富集。遺傳證據(jù)和RNA-seq分析表明，phyB負調(diào)控BR信號途徑。總之，該研究揭示了光激活的phyB通過直接與BR信號途徑核心轉(zhuǎn)錄因子BZR1相互作用，從而負調(diào)控BR介導(dǎo)下胚軸伸長生長。Fig1.IdentificationofphyB-interactingtranscriptionfactorsLCIassaysshowingtheinteractionsbetweenphyBandtranscriptionfactorsinN.benthamianaleavesunderdarkandredlightconditions.Representativeimages