(自動(dòng))核酸提取儀校準(zhǔn)規(guī)范

JJF1874—20201(自動(dòng))核酸提取儀校準(zhǔn)規(guī)范1范圍本規(guī)范適用于全自動(dòng)核酸提取儀和半自動(dòng)核酸提取儀的校準(zhǔn)。2引用文件本規(guī)范引用了下列文件:JJF1059.1—2012測量不確定度評定與表示JJF1101—2019環(huán)境試驗(yàn)設(shè)備溫度、濕度校準(zhǔn)規(guī)范JJF1527—2015聚合酶鏈反應(yīng)分析儀校準(zhǔn)規(guī)范凡是注日期的引用文件,僅注日期的版本適用于本規(guī)范;凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改單)適用于本規(guī)范。3概述(自動(dòng))核酸提取儀(以下簡稱提取儀)是應(yīng)用核酸提取試劑完成樣本核酸提取的一類核酸提取純化設(shè)備,其原理是在一定溫度、振動(dòng)等條件下,對樣本進(jìn)行裂解、提取和純化。提取儀由溫控系統(tǒng)、振蕩系統(tǒng)、取液系統(tǒng)和分離純化系統(tǒng)全部或部分組成。4計(jì)量特性4.1溫度示值誤差4.2溫度均勻性4.3溫度穩(wěn)定性4.4振動(dòng)頻率示值誤差4.5振動(dòng)頻率穩(wěn)定性4.6取液量示值誤差4.7取液量重復(fù)性4.8取液量一致性4.9核酸提取回收率一致性4.10核酸提取回收率重復(fù)性4.11核酸提取回收率5校準(zhǔn)條件5.1環(huán)境條件5.1.1環(huán)境溫度:(10~30)℃。5.1.2相對濕度:≤80%。5.1.3提取儀所在室內(nèi)不得有明顯的機(jī)械振動(dòng),無電磁干擾。JJF1874—20202 5.1.4其他允許的環(huán)境條件。 5.2校準(zhǔn)設(shè)備和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)5.2.1溫度測量裝置可至少同時(shí)測量7組溫度數(shù)據(jù),測量范圍(0~120)℃,最大允許誤差±0.3℃。5.2.2振動(dòng)頻率測量裝置測量范圍為(0.1~500)Hz,0.1級或優(yōu)于0.1級。5.2.3電子天平分度值0.1mg,最大稱量值≥200g,滿足?級要求,經(jīng)過計(jì)量檢定或校準(zhǔn)。5.2.4核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)5.2.濃度≥1000ng/μL,相對擴(kuò)展不確定度Urel≤5%(k=2)。經(jīng)過校準(zhǔn),或用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)定。6校準(zhǔn)項(xiàng)目和校準(zhǔn)方法6.1溫度示值誤差溫度點(diǎn)一般選擇55℃、65℃、90℃,或者其他有實(shí)際需要的溫度為校準(zhǔn)點(diǎn)。使用溫度測量裝置,將溫度傳感器固定在提取儀的加熱模塊上,溫度傳感器均勻分布,保證溫度傳感器與加熱模塊貼合緊密。對于不同加熱模塊的提取儀,可根據(jù)實(shí)際情況均勻選取測量點(diǎn),測溫點(diǎn)數(shù)選取規(guī)則如下:提取儀孔位數(shù)48位~96位,測溫點(diǎn)選7個(gè);提取儀孔位數(shù)8位~48位,測溫點(diǎn)選5個(gè);提取儀孔位數(shù)8位及以下的,測溫點(diǎn)選3個(gè)。設(shè)定被校提取儀的校準(zhǔn)溫度,穩(wěn)定10min或以上,待溫度穩(wěn)定后,讀取測溫點(diǎn)的溫度值,根據(jù)公式(1)和公式(2)計(jì)算溫度的示值誤差。ΔTa=Ts-T(1)T=式中:Tii=1ΔTa———溫控工作區(qū)域內(nèi)溫度示值誤差,℃;Ts———溫控工作區(qū)域內(nèi)設(shè)定溫度值,℃; T———所有測溫點(diǎn)溫度傳感器測量值的平均值,℃;Ti———第i個(gè)溫度傳感器測量值,℃;n———測溫點(diǎn)數(shù)量。6.2溫度均勻性分別測試提取儀溫度設(shè)定為55℃、65℃、90℃(也可選擇其他有實(shí)際需要的溫度進(jìn)行測試)時(shí)工作區(qū)域的溫度均勻性。根據(jù)公式(3)計(jì)算溫度的均勻性。ΔTu=Tmax-Tmin(3)式中:ΔTu———溫度均勻性,℃;JJF1874—20203Tmax—所有測溫點(diǎn)溫度傳感器測量值的最大值,℃;Tmin—所有測溫點(diǎn)溫度傳感器測量值的最小值,℃。注:若提取儀提取通道少于3個(gè),則不做均勻性考察。6.3溫度穩(wěn)定性測試提取儀溫度設(shè)定為65℃時(shí)加熱區(qū)域的溫度穩(wěn)定性。待提取儀溫度穩(wěn)定后,測試10min,隔1min記錄一次所有測溫點(diǎn)溫度傳感器測量平均值,這些平均值極差的一半,冠以±號表示溫度的穩(wěn)定性。根據(jù)公式(4)計(jì)算溫度的穩(wěn)定性。ΔTw=±(Tmax-Tmin)(4)式中:ΔTw—溫度穩(wěn)定性,℃;Tmax—所有測溫點(diǎn)溫度傳感器測量平均值中的最大值,℃;Tmin—所有測溫點(diǎn)溫度傳感器測量平均值中的最小值,℃。6.4振動(dòng)頻率示值誤差校準(zhǔn)振動(dòng)頻率點(diǎn)選取提取儀頻率設(shè)定最大值的20%(低)、50%(中)、80%(高)測量。待提取儀穩(wěn)定5min后,設(shè)定待測頻率值,分別測量低、中、高提取儀振動(dòng)頻率的示值,每個(gè)頻率測量3次,根據(jù)公式(5)和公式(6)計(jì)算振動(dòng)頻率的示值誤差。ΔFa=Fs-F(5)F=Fi(6) ΔFa ΔFa—振動(dòng)頻率示值誤差,Hz;Fs—振動(dòng)頻率設(shè)定值,Hz; F—n次測量振動(dòng)頻率的平均值,Hz;Fi—第i次振動(dòng)頻率測量值,Hz;n—測量次數(shù)。注:若提取儀振動(dòng)頻率沒有具體數(shù)值,則此項(xiàng)可以不做。6.5振動(dòng)頻率穩(wěn)定性測試提取儀振動(dòng)頻率設(shè)定為中等值時(shí)振動(dòng)頻率的穩(wěn)定性。選取振動(dòng)頻率為設(shè)定最大值的50%,待提取儀振動(dòng)穩(wěn)定后,測試10min,隔1min記一次振動(dòng)頻率,10min之內(nèi)測得的振動(dòng)頻率極差的一半,冠以±號表示振動(dòng)頻率的穩(wěn)定性。根據(jù)公式(7)計(jì)算振動(dòng)頻率的穩(wěn)定性。ΔFw=±(Fmax-Fmin)(7)式中:ΔFw—振動(dòng)頻率穩(wěn)定性,Hz;4 Fmax—振動(dòng)頻率測量值的最大值,Hz; Fmin—振動(dòng)頻率測量值的最小值,Hz。6.6取液量示值誤差分別設(shè)定提取儀取液量為50μL、100μL、200μL,或者其他有實(shí)際需要的取液量作為校準(zhǔn)點(diǎn)。超純水作為被取液,選擇一個(gè)通道,每個(gè)取液量測量3次,用電子天平稱量所取液體質(zhì)量,根據(jù)實(shí)驗(yàn)溫度時(shí)水的密度,將所取液體的質(zhì)量換算成體積,根據(jù)公式(8)和公式(9)計(jì)算取液量的示值誤差。ΔVa=Vs-V(8)1nV1nΔVa—取液量示值誤差,μL;Vs—取液量設(shè)定值,μL;Vii=1(9)V—n次取液量測量值的平均值,μL;Vi—第i次取液量測量值,μL;n—測量次數(shù)。6.7取液量重復(fù)性測試取液量設(shè)定值為100μL時(shí)提取儀取液量的重復(fù)性。選擇一個(gè)通道重復(fù)取液7次,用電子天平稱量所取液體質(zhì)量,根據(jù)實(shí)驗(yàn)溫度時(shí)水的密度,將所取液體的質(zhì)量換算成體積,根據(jù)公式(10)計(jì)算不同取液量的重復(fù)性。RSD=(nV-iV)2××100%(10)式中:RSD—相對標(biāo)準(zhǔn)偏差,%;Vi—第i次取液量測量值,μL;V—n次取液量的平均值,μL;n—取液次數(shù)。6.8取液量一致性測試取液量設(shè)定值為100μL時(shí)提取儀取液量的一致性。用提取儀的多通道取液器取液一次,用電子天平分別稱量各通道取液的質(zhì)量,根據(jù)實(shí)驗(yàn)溫度時(shí)水的密度,將所取液體的質(zhì)量換算成體積,所有通道取液體積的極差表示取液量的一致性。根據(jù)公式(11)計(jì)算取液量的一致性。ΔVu=Vmax-Vmin(11)式中:ΔVu—取液量一致性,μL;Vmax—所有通道取液量的最大值,μL;5Vmin—所有通道取液量的最小值,μL。注:若提取儀取液通道少于3個(gè),則此項(xiàng)可以不做。6.9核酸提取回收率一致性a)選擇有證核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),采用微量分光光度計(jì)測量其濃度,取3次測量的平均值作為核酸提取前的初始濃度。b)用提取儀對有證核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行核酸提取。根據(jù)實(shí)際情況,參考6.1中的選點(diǎn)方式,均勻選取測量點(diǎn)進(jìn)行一致性考察。c)將每個(gè)孔中提取好的核酸樣品溶液,分別用微量分光光度計(jì)測量其濃度。d)對比提取前后的核酸濃度,計(jì)算提取回收率。測試核酸標(biāo)準(zhǔn)溶液提取回收率的一致性,按6.1中的原則選取測試孔位,測量每個(gè)孔位提取后樣品溶液中的核酸回收濃度。根據(jù)公式(12)、公式(13)和公式(14)計(jì)算所選孔位間核酸提取回收率的一致性。ΔCu=λ×(Cmax-Cmin)(12)λ=(13)ΔRu=×100%(14)式中:ΔCu—核酸回收濃度最大差值,ng/μL;Cmax—所有核酸回收濃度測量值的最大值,ng/μL;Cmin—所有核酸回收濃度測量值的最小值,ng/μL;λ—提取后的總體積和提取前加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的體積比值;Vc—提取后的總體積,μL;V0—提取前加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的體積,μL;C0—初始濃度,ng/μL;ΔRu—回收率一致性,%。注:若提取儀提取通道少于3個(gè),則不做一致性考察。6.10核酸提取回收率重復(fù)性按6.1中的原則選取測試孔位進(jìn)行核酸提取,把所有測試孔位提取后的樣品溶液混合均勻,用微量分光光度計(jì)測量核酸濃度,計(jì)算核酸提取回收率作為一次測量結(jié)果,重復(fù)提取測量3次,根據(jù)公式(15)計(jì)算核酸提取回收率的重復(fù)性。RSD=××100%(15)式中:RSD—相對標(biāo)準(zhǔn)偏差,%;Rmax—n次回收率測量值中的最大值,%;Rmin—n次回收率測量值中的最小值,%; R—n次測量回收率的平均值,%;6R=λ× Cn—極差系數(shù),n=3時(shí),CnR=λ× 6.11核酸提取回收率 CC0×100%(16)把6.9得到的所有測試孔位提取后的樣品溶液混合均勻,用微量分光光度計(jì)測量核酸濃度,重復(fù)測量3次,根據(jù)公式(16)和公式(17) CC0×100%(16)1nC1n式中:R—核酸提取回收率,%;Cii=1(17)C—n次測量濃度的平均值,ng/μL;C0—初始濃度,ng/μL。7校準(zhǔn)結(jié)果表達(dá)經(jīng)校準(zhǔn)后的提取儀,出具校準(zhǔn)證書,校準(zhǔn)證書應(yīng)符合JJF1071—2010中5.12的要求,校準(zhǔn)原始記錄格式參見附錄A,校準(zhǔn)證書(內(nèi)頁)格式參見附錄B。8復(fù)校時(shí)間間隔由于復(fù)校時(shí)間間隔的長短是由提取儀的使用情況、使用者、提取儀本身質(zhì)量等諸因素所決定的,因此,送校單位可根據(jù)實(shí)際使用情況自主決定復(fù)校時(shí)間間隔。建議復(fù)校時(shí)間間隔不超過1年。JJF1874—20207附錄A校準(zhǔn)原始記錄格式(參考)(自動(dòng))核酸提取儀校準(zhǔn)記錄共3頁第1頁儀器名稱室溫/℃儀器型號相對濕度/%制造廠校準(zhǔn)員出廠編號核驗(yàn)員委托單位委托單號記錄編號證書編號聯(lián)系人及電話校準(zhǔn)日期校準(zhǔn)使用的儀器設(shè)備名稱測量范圍不確定度/準(zhǔn)確度等級/最大允許誤差檢定/校準(zhǔn)證書編號有效期至1.溫度示值誤差及均勻性溫度℃Ti/℃T℃ aΔTa℃ΔTu℃12345675565902.溫度穩(wěn)定性溫度℃ T/℃ ΔTw℃0min1min2min3min4min5min6min7min8min9min10min658共3頁第2頁3.振動(dòng)頻率示值誤差振動(dòng)頻率Fs/HzFi/Hz F/Hz ΔFa/Hz123低中高4.振動(dòng)頻率穩(wěn)定性振動(dòng)頻率F/HzΔFw/Hz0min1min2min3min4min5min6min7min8min9min10min中5.取液量示值誤差取液量/μLVi/μL V/μL ΔVa/μL123501002006.取液量重復(fù)性取液量/μLVi/μL V/μLRSD/%12345671007.取液量一致性取液量/μLV/μLΔVu/μL123456781008.核酸提取回收率一致性Vc/μLV0/μLλ9共3頁第3頁C0/(ng/μL)Cu/(ng/μL)ΔCu/(ng/μL)ΔRu/%12345679.核酸提取回收率重復(fù)性C0/(ng/μL)Ci/(ng/μL)Ri/%Rmax-RminCnR/%RSD/%12312310.核酸提取回收率C0/(ng/μL)Ci/(ng/μL) C/(ng/μL)R/%12310附錄B校準(zhǔn)證書(內(nèi)頁)格式校準(zhǔn)結(jié)果校準(zhǔn)項(xiàng)目校準(zhǔn)結(jié)果溫度示值誤差/℃標(biāo)稱值測量值示值誤差擴(kuò)展不確定度(k=2)溫度均勻性/℃標(biāo)稱值均勻性溫度穩(wěn)定性/℃振動(dòng)頻率示值誤差/Hz標(biāo)稱值測量值示值誤差擴(kuò)展不確定度(k=2)振動(dòng)頻率穩(wěn)定性/Hz取液量示值誤差/μL標(biāo)稱值測量值示值誤差擴(kuò)展不確定度(k=2)取液量一致性/μL標(biāo)稱值一致性11表(續(xù))取液量重復(fù)性標(biāo)稱值/μL重復(fù)性/%核酸提取回收率一致性/%核酸提取回收率重復(fù)性/%核酸提取回收率/%核酸提取回收率擴(kuò)展不確定度/%(k=2)校準(zhǔn)員:核驗(yàn)員:12附錄C溫度示值誤差校準(zhǔn)結(jié)果的不確定度評定示例C.1測量模型ΔTa=Ts-T(C.1)式中: ΔTa—溫控工作區(qū)域內(nèi)溫度示值誤差,℃;Ts—溫控工作區(qū)域內(nèi)設(shè)定溫度值,℃; T—所有測溫點(diǎn)溫度傳感器測量值的平均值,℃。C.2不確定度來源溫度示值誤差校準(zhǔn)結(jié)果的不確定度來源主要為:a)測量重復(fù)性引入的不確定度;b)溫度測量裝置引入的不確定度。C.3標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量的評定C.3.1測量重復(fù)性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(T)在各個(gè)溫度測量時(shí)間段內(nèi),讀取7個(gè)測溫探頭的數(shù)據(jù),見表C.1,計(jì)算其實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)偏差s。表C.1重復(fù)性引入不確定度數(shù)據(jù)溫度/℃測量結(jié)果Ti/℃s/℃12345675550.3150.8950.7851.0451.8951.7650.710.576560.8459.9861.2560.9961.3361.0459.660.659084.0384.4184.8384.5284.6683.0484.670.61根據(jù)測量結(jié)果計(jì)算: (Ti-(Ti-T)2u(T)=結(jié)果見表C.2。(C.2)(C.3)C.3.2溫度測量裝置引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(Ts)溫度測量裝置校準(zhǔn)不確定度按最大允許誤差計(jì)算。u(Ts)=a/k=0.3℃/3=0.17℃13C.4標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量匯總表表C.2標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量匯總表溫度/℃標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量 u(T)/℃ u(Ts)/℃550.570.17650.650.17900.610.17C.5合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度合成標(biāo)準(zhǔn)不確定為uc(ΔTa)=u2(T)+u2(Ts)結(jié)果列于表C.3。C.6擴(kuò)展不確定度取包含因子k=2,則擴(kuò)展不確uc(ΔTa)結(jié)果列于表C.3。表C.3合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度和擴(kuò)展不確定度溫度/℃ uc(ΔTa)/℃ U/℃包含因子k550.591.22650.671.42900.631.3214附錄D振動(dòng)示值誤差校準(zhǔn)結(jié)果的不確定度評定示例D.1測量模型ΔFa=Fs-F(D.1)式中: ΔFa—振動(dòng)頻率示值誤差,Hz;Fs—振動(dòng)頻率設(shè)定值,Hz; F—n次測量振動(dòng)頻率的平均值,Hz。D.2不確定度來源振動(dòng)示值誤差校準(zhǔn)結(jié)果的不確定度來源主要為:a)測量重復(fù)性引入的不確定度;b)標(biāo)準(zhǔn)頻率檢測儀引入的不確定度。D.3標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量的評定D.3.1重復(fù)性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(F)在低、中、高三個(gè)頻率振動(dòng)點(diǎn),分別讀取10次檢測數(shù)據(jù),結(jié)果見表D.1,計(jì)算其實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)偏差s。表D.1重復(fù)性引入不確定度數(shù)據(jù)頻率振動(dòng)點(diǎn)Fs/Hz測量結(jié)果Fi/Hzs/Hz12345678910低22.22.12.42.32.22.12.12.32.22.10.11中55.15.35.45.25.45.15.35.25.35.10.12高88.38.28.48.48.18.28.18.38.38.20.11根據(jù)測量結(jié)果計(jì)算: (Fi-(Fi-F)2u(F)=結(jié)果見表D.2。(D.2)(D.3)D.3.2振動(dòng)頻率測量裝置引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u2(Fs)振動(dòng)頻率測量裝置校準(zhǔn)不確定度按裝置的最大允許誤差計(jì)算。u(Fs)=a/k=FS×0.1%/3=0.29Hz15D.4標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量匯總表表D.2標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量匯總表頻率振動(dòng)點(diǎn)Fs/Hz標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量 u(F)/Hz u(Fs)/Hz低20.0640.29中50.0690.29高80.0640.29D.5合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為uc(ΔFa)=u2(F)+u2(Fs)結(jié)果列于表D.3。D.6擴(kuò)展不確定度取包含因子k=2,則擴(kuò)展不確uc(ΔFa)結(jié)果列于表D.3。表D.3合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度和擴(kuò)展不確定度頻率振動(dòng)點(diǎn)Fs/Hz uc(ΔFa)/Hz U/Hz包含因子k低20.300.602中50.300.602高80.300.60216附錄E取液量示值誤差校準(zhǔn)結(jié)果的不確定度評定示例E.1測量模型ΔVa=Vs-V(E.1)式中: ΔVa—取液量示值誤差,μL;Vs—取液量設(shè)定值,μL; V—n次取液量測量值的平均值,μL;E.2不確定度來源取液量示值誤差校準(zhǔn)結(jié)果的不確定度來源主要為:a)測量重復(fù)性引入的不確定度;b)電子天平引入的不確定度。E.3標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量的評定E.3.1重復(fù)性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(V)設(shè)定取液量為50μL、100μL、200μL,每個(gè)取液量設(shè)定點(diǎn)分別測量10次取液量,結(jié)果見表E.1,計(jì)算其實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)偏差s。表E.1重復(fù)性引入不確定度數(shù)據(jù)Vs/μLVi/μLs/μL123456789105047.2450.1148.6949.1048.1848.2147.8848.5147.7147.840.8110099.4599.38100.299.1697.8499.4598.3599.8698.3597.500.89200200.1198.6200.9198.2199.0200.3199.8198.6199.5200.50.92根據(jù)測量結(jié)果計(jì)算: (Vi-V(Vi-V)2u(V)=結(jié)果見表E.2。(E.2)(E.3)E.3.2電子天平引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(Vs)電子天平引入的不確定度按電子天平的最大允許誤差計(jì)算。u(Vs)=a/k=0.5mg/(0.996511mg/μL×3)=0.29μL17E.4標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量匯總表表E.2標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量匯總表Vs/μL標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量 u(V)/μL u(Vs)/μL500.470.291000.510.292000.530.29E.5合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為uc(ΔVa)=u2(V)+u2(Vs)結(jié)果列于表E.3。E.6擴(kuò)展不確定度取包含因子k=2,則擴(kuò)展不確uc(ΔVa)結(jié)果列于表E.3。表E.3合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度和擴(kuò)展不確定度Vs/μL uc(ΔVa)/μL U/μL包含因子k500.551.121000.591.222000.601.22JJF1874—202018 附錄F 核酸提取回收率校準(zhǔn)結(jié)果不確定度評定示例F.1測量模型R=λ××100%(F.1)C=Ci(F.2)式中:R—核酸提取回收率;C—n次測