熒光素酶實驗-第四篇

雙熒光素酶報告基因檢測（四）啟動子能活化RNA聚合酶，使之與模板DNA準確地相結(jié)合并具有轉(zhuǎn)錄起始的特異性；轉(zhuǎn)錄因子（TFs）調(diào)節(jié)基因表達，保證目的基因以特定的強度在特定的時間與空間表達的蛋白質(zhì)分子。將啟動子區(qū)域序列插入到報告基因載體（常用載體為pGL3-BasicVector，將待檢測的啟動子序列構(gòu)建在報告基因上游），同時在細胞實驗中共表達轉(zhuǎn)錄因子，分析熒光素酶表達水平，反應轉(zhuǎn)錄因子是否影響基因表達情況。轉(zhuǎn)錄因子與基因啟動子相互作用轉(zhuǎn)錄因子與基因啟動子相互作用的研究屬于轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面的研究，也是研究相對集中的基因表達調(diào)控方式。轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析不能盲目地為了研究具體機制而做研究，需要與基因功能研究密切聯(lián)系起來作為前提條件。熒光素酶報告基因分析可以有效地在體外評估轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控啟動子的能力。對于轉(zhuǎn)錄因子與啟動子互作驗證，目前普遍采用基于pGL3-basic載體的雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)。當然，如果目的啟動子活性較強，使用pGL3-basic即可；若啟動子活性較弱，可以選擇帶有強啟動子的pGL3-enhancer或promoter載體。pGL3-basic系統(tǒng)需要用到三種質(zhì)粒：（1）pGL3-basic：帶有目標啟動子序列的報告質(zhì)粒，螢火蟲熒光素酶(fLuc)作為報告基因；（2）pRL-TK：內(nèi)參質(zhì)粒，海腎熒光素酶(rLuc)作為內(nèi)參基因，使fLuc的檢測均一化；（3）pcDNA3.1：轉(zhuǎn)錄因子過表達質(zhì)粒。構(gòu)建好以上三種質(zhì)粒后，共同轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染至哺乳動物細胞。用于報告基因分析的細胞可以選擇具有轉(zhuǎn)染效率高、易培養(yǎng)等優(yōu)點的工具細胞，如HEK293細胞，這已得到廣泛的認可，也是較為常見的做法。當然也可以使用實驗所用的目的細胞，或根據(jù)個人實際情況選擇常見、合適的細胞。①將靶啟動子片段插入到螢火蟲熒光素酶表達序列前方，構(gòu)建實驗報告基因質(zhì)粒；②將要檢測的轉(zhuǎn)錄因子表達質(zhì)粒與兩種報告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染相關(guān)細胞；備注：如果此轉(zhuǎn)錄因子能夠激活靶啟動子，則螢火蟲熒光素酶基因就會表達，并且螢火蟲熒光素酶的表達水平與轉(zhuǎn)錄因子的作用強度成正比。③經(jīng)細胞培養(yǎng)后裂解細胞，離心取上清，隨后分別加入兩種熒光素酶底物，熒光素酶與底物反應產(chǎn)生熒光，通過檢測熒光的強度測定熒光素酶的活性，從而判斷轉(zhuǎn)錄因子是否與該啟動子存在相互作用。轉(zhuǎn)錄因子與基因啟動子相互作用關(guān)于靶基因啟動子序列，通常選取轉(zhuǎn)錄起始位點上游2000bp的區(qū)域作為啟動子區(qū)，再運用預測轉(zhuǎn)錄因子與啟動子結(jié)合的數(shù)據(jù)庫分析二者結(jié)合的可能性及潛在結(jié)合位點，常用的數(shù)據(jù)庫有JASPAR（推薦）、PROMO等。那么轉(zhuǎn)錄因子與啟動子互作分析一般可以有以下幾個方面。首先可以初步明確轉(zhuǎn)錄因子對靶基因具有轉(zhuǎn)錄激活或轉(zhuǎn)錄抑制作用；接著需要明確轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點，就必須構(gòu)建啟動子的截短體或突變體等，分別進行驗證雙熒光素酶驗證分析。一般情況下，轉(zhuǎn)錄因子都具有轉(zhuǎn)錄激活/抑制結(jié)構(gòu)域和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，可以針對這兩個區(qū)域構(gòu)建轉(zhuǎn)錄因子突變體，通過比較野生型和突變型轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控能力，研究其轉(zhuǎn)錄調(diào)控能力。1、構(gòu)建全長啟動子分析：明確轉(zhuǎn)錄因子對靶基因啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。2、構(gòu)建啟動子截短體分析：將啟動子上轉(zhuǎn)錄因子的潛在結(jié)合位點進行缺失，構(gòu)建啟動子截短體，與全長啟動子比較，明確缺失區(qū)域是否在轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用的重要位置。3、構(gòu)建啟動子點突變分析：通過啟動子的截短體我們可以驗證轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用是否與潛在結(jié)合位點相關(guān)，隨后可以進一步對這些潛在結(jié)合位點進行點突變，探討結(jié)合位點堿基突變是否影響轉(zhuǎn)錄因子對靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控能力。4、構(gòu)建轉(zhuǎn)錄因子突變體分析：另外還可以構(gòu)建轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)功能域的突變體或截短體，研究轉(zhuǎn)錄因子的功能結(jié)構(gòu)域。另外，實驗設計分組也是比較關(guān)鍵的，只是明確轉(zhuǎn)錄調(diào)控關(guān)系一般分四組，進一步研究結(jié)合位點則每研究一個位點就增加兩組實驗。卡梅德生物（KMDBioscience）(/)建立了完善的細胞培養(yǎng)平臺，能夠提供給客戶多種細胞學基礎實驗，可以提供優(yōu)質(zhì)的免疫檢測服務—雙熒光素酶標記基因檢測。我們從以下文獻來進行進一步分析：案例文獻標題：InterruptionofTRPC6-NFATC1signalinginhibitsNADPHoxidase4andVSMCsphenotypicswitchinintracranialaneurysm.DOI：10.1016/j.biopha.2023.114480安徽醫(yī)科大學李維祖教授在研究顱內(nèi)動脈瘤時發(fā)現(xiàn)NOX4在TNF-α誘導的A7R5細胞中被激活，抑制TRPC6-NFATC1信號通路可顯著下調(diào)NOX4的表達。為驗證NFATC1與NOX4的結(jié)合機制，作者通過人轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫（HumanTFDB）預測到NFATC1在人NOX4啟動子區(qū)域可能結(jié)合的3個位點。利用pGL3-basic構(gòu)建了這3個可能結(jié)合位點（TFBSs）及相應位點突變的報告載體。結(jié)果顯示NFATC1可以直接結(jié)合NOX4啟動子，參與NOX4轉(zhuǎn)錄，并確定了NFATC1可以結(jié)合到NOX4啟動子的TFBS2和TFBS3上，調(diào)控NOX4的轉(zhuǎn)錄。這些發(fā)現(xiàn)為了解顱內(nèi)動脈瘤的發(fā)病機制和延遲顱內(nèi)動脈瘤的必要策略提供了依據(jù)。圖1.NFATC1與NOX4啟動子的雙熒光素酶驗證文獻標題：LongnoncodingRNAKB-1460A1.5inhibitsgliomatumorigenesisviamiR-130a-3p/TSC1/mTOR/YY1feedbackloop.DOI:10.1016/j.canlet.2021.10.033李慶國發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)瘤中KB-1460A1.5表現(xiàn)為低表達情況，為了解析這一機制，作者對KB-1460A1.5上游區(qū)域進行了分析。首先通過PROMO網(wǎng)站篩選了可能與KB-1460A1.5結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，并通過這些因子在膠質(zhì)瘤中的表達與KB-1460A1.5的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)YY1極有可能參與調(diào)控KB-1460A1.5的表達。通過構(gòu)建YY1過表達載體及KB-1460A1.5啟動的pGL3載體進行雙熒光素酶報告基因檢測驗證。結(jié)果顯示，YY1