第五章 細胞破碎

細胞破碎技術1

發(fā)酵液預處理細胞分離細胞破壁碎片分離提取精制成品制作加熱過濾勻漿法離心沉淀(重結晶)濃縮調(diào)pH離心研磨法雙水相吸附離子交換干燥絮凝膜分離酶解法膜分離萃取色譜分離無菌超濾膜分離過濾結晶成型（胞外產(chǎn)物）（胞內(nèi)產(chǎn)物）

生化分離技術一般步驟2

生物樣品的預處理

預處理是從生物樣品中提取目的產(chǎn)品的第一個步驟.因為生物樣品中往往含有大量有機物、無機物及各種微量元素等,因此要對目標組分進行初步富集和分離,對干擾組分進行初步去除.預處理材料種類:各種生物反應的懸浮液,包括動物細胞培養(yǎng)液、植物細胞培養(yǎng)液、微生物發(fā)酵液、動物血液、乳液和動植物組織提取液等.

3生物樣品的預處理

分離對象－發(fā)酵液或細胞懸浮液特點1）目標產(chǎn)物濃度普遍較底，懸浮液中大部分是水;2）組分復雜，含有細胞，細胞碎片，蛋白質，核酸，脂類，無機鹽等多種物質；3）由于pH,離子強度，溫度等變化因素，分離過程易造成失活和污染現(xiàn)象；4）性質不穩(wěn)定，隨時間變化。4生物樣品的預處理

因為發(fā)酵液的上述特性,所以使發(fā)酵液的過濾與分離相當困難.在分離過程中應該作做到1.迅速加工,縮短停留時間,2.控制好操作溫度和pH,3.減少或避免與空氣接觸受污染的機會,4.總體設計好各組分的分離順序.通過對發(fā)酵液進行適當?shù)念A處理,改善其流體性能,提高過濾與分離的速率.5主要內(nèi)容一、概述

二、常用的細胞破碎技術三、細胞破碎技術研究的發(fā)展方向

四、思考題6一、概述（一）細胞破碎的意義（二）細胞壁的成分與結構（三）細胞破碎過程的檢測7一:概述微生物代謝產(chǎn)物大多數(shù)分泌到細胞外,如大多數(shù)小分子代謝物、細菌產(chǎn)生的堿性蛋白酶、霉菌產(chǎn)生的糖化酶等,稱為胞外產(chǎn)物.但有些目的物存在于細胞內(nèi)部,如大多數(shù)酶蛋白、類脂和部分抗生素等,稱為胞內(nèi)產(chǎn)物.分離提取胞內(nèi)產(chǎn)物時首先將細胞破碎,目的是釋放細胞內(nèi)產(chǎn)物.8胞外產(chǎn)品：各種胞外酶、胞外多糖、細胞代謝物細胞本身：單細胞蛋白（SCP）胞內(nèi)產(chǎn)品:堿性磷酸酯酶，基因工程產(chǎn)物，植物細胞產(chǎn)物等9細胞破碎就是采用物理、化學、酶或機械的方法，在一定程度上破壞細胞壁和細胞膜，設法使胞內(nèi)產(chǎn)物最大程度地釋放到液相中。10（一）細胞破碎的意義細胞破碎技術是分離純化細胞內(nèi)合成的非分泌型成分的基礎。有效的細胞破碎對分離和純化任何細胞內(nèi)活性藥物成分都是必要的。細胞破碎與上游和下游工藝設計的關系上游通過細胞的生理狀態(tài)對細胞破碎效果產(chǎn)生影響；而下游則要考慮去除細胞碎片和細胞蛋白質的污染等對產(chǎn)品活性的影響。細胞破碎過程中必須考慮的因素

細胞壁的堅韌程度、目標產(chǎn)品的性質、破碎的規(guī)模、方法、費用等.11（二）細胞壁的成分與結構細菌細胞壁

主要成分是肽聚糖，由N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰胞壁酸和短肽聚合而成的多層網(wǎng)狀結構。

霉菌的細胞壁

大多由幾丁質和葡聚糖構成，還含有少量蛋白質和脂類。酵母和真菌的細胞壁

主要為葡聚糖為β-1，6葡聚糖，通過β-1，3糖苷鍵與D-葡萄糖第一側鏈交聯(lián)，也含有甘露糖和幾丁質植物細胞壁含纖維素、半纖維素、木質素等12G-細胞壁的肽聚糖層較薄,僅2-3nm,在肽聚糖層外壁層的厚度8-10nm,主要為脂蛋白,脂多糖和其他脂類.可見G+細胞壁較厚,較為難破碎.13破碎細菌的主要阻力是來自于肽聚糖的網(wǎng)狀結構，其網(wǎng)結構的致密程度和強度取決于聚糖鏈上所存在的肽鍵的數(shù)量和交聯(lián)的程度，如果交聯(lián)程度越大，則網(wǎng)結構就越致密。G+肽聚糖層：20-80nmG-肽聚糖層：2-3nm細菌肽聚糖結構示意圖14酵母菌細胞壁主要組成：葡聚糖與甘露聚糖以及蛋白質等。特點：細胞壁厚度比G--稍厚些。70nm.

厚度隨著菌齡增加而增加，并對細胞壁的剛性和強度起著一定的作用。主要阻力：細胞壁結構交聯(lián)的緊密程度和它的厚度。15真菌的細胞壁主要組成：多數(shù)真菌的細胞壁較厚，約為100-250nm,主要由多糖組成，其次含有少量的蛋白質和脂類。多糖壁：幾丁質和葡聚糖真菌細胞壁強度與聚合物網(wǎng)狀結構有關。a.-和-葡聚糖混合物;b.糖蛋白的網(wǎng)狀結構,葡聚糖結合到蛋白材料中;c.主要的蛋白質材料;d.幾丁質的內(nèi)層區(qū),幾丁質的微纖嵌入蛋白質材料中.16植物細胞壁的化學組成與結構

細胞壁：初生壁（1-3

m,多糖與蛋白質組成）和次生壁（4

m）。

17主要特征：

在次生壁中，纖維素和半纖維素含量比初生壁增加很多，纖維素的微纖絲排列更緊密和有序。木質素（酚類聚合物）的沉積。結果：提高了細胞的堅硬性，使植物細胞具有很高的機械強度。18（三）細胞破碎過程的檢測①革蘭氏染色法②次甲基藍染色法③測定核酸與蛋白質含量19①革蘭氏染色法

用革蘭氏染色劑進行染色破壁的酵母呈粉紅色，而未破壁的酵母呈蘭紫色，分別計數(shù)，并采用相同的稀釋度用血球記數(shù)板進行鏡檢記數(shù)，計算破壁率。α---破壁率（100%）C---破壁前的細胞數(shù)（相同稀釋倍數(shù)）C’---破壁后的細胞數(shù)（相同稀釋倍數(shù)）n1---染色后呈紫色細胞數(shù)n2---染色后呈粉紅色細胞數(shù)20②次甲基藍染色法

取未經(jīng)滅活的發(fā)酵液0.5ｍＬ,用9ｇ/Ｌ的生理鹽水稀釋100倍后,用次甲基藍染色5ｍｉｎ,用血球計數(shù)板計數(shù),計算出細胞的存活率。酵母存活率：

=[1-(染色細胞總數(shù)/酵母細胞總數(shù))]×100%.21

③測定核酸與蛋白質含量

分別在260和280ｎｍ波長下,測定發(fā)酵液的光吸收值，用Lowry法測量細胞破碎后上清中的蛋白質含量也可以評估細胞的破碎程度，判斷細胞破碎率。核酸提取率：=[(處理后發(fā)酵液的吸光值/未處理發(fā)酵液的吸光值)-1]×100%22Lowry法是最為靈敏的蛋白濃度測定方法之一，是已知的被引用最多的蛋白質定量方法。加入Folin-Ciocalteu試劑試劑后，試劑中的磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽在堿性條件下，易被蛋白質中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，呈藍色反應。在一定的條件下，藍色深度與蛋白的量成正比。最后在500nm檢測該顏色反應的吸光值，與標準對照計算出蛋白質的濃度。23二、常用的細胞破碎技術破碎方法機械法非機械法固體剪切力液體剪切力珠磨法壓榨干燥處理溶液作用高壓勻漿超聲破碎酶溶法化學法物理法細胞破碎技術的基本分類是否使用外加作用力24細胞破碎機理圖25機械破碎法與非機械法比較

26（一）高速珠磨法掌握珠磨法破碎細胞原理（1）作用機理：微生物細胞懸浮液與極細的玻璃小珠、石英砂、氧化鋁等研磨劑（直徑小于1mm）充分混合。珠子之間以及珠子之間和細胞之間的相互剪切，碰撞，促使細胞破裂，釋放內(nèi)含物。在珠液分離器作用的協(xié)助下，珠子被滯留在破碎室內(nèi)，漿液流出。27常用的細胞破碎技術28操作參數(shù)：轉速進料速度珠子直徑珠子用量細胞濃度冷卻溫度

29WSK臥式高效全能珠磨機Crushinginballmill珠磨法

30ZM系列臥式密閉珠(砂)磨機3132溫控與能耗：溫控：采用夾套冷卻能耗：珠磨破碎能耗和細胞破碎率成正比,提高破碎率，需要增加裝珠量或延長破碎時間。提高轉速:這些措施不僅僅導致電能消耗，而且產(chǎn)生較多能量，引起漿液溫度升高，引起酶的變性失活。缺點：處理8ml懸浮液，最終只能得到5ml左右的漿液,損失率較高。漿液損失起因33C=6%C=11%X=90%X=80%C---X-34常用的細胞破碎技術(一)珠磨法4.影響因素珠磨機硬件確定后,影響因素有轉速、進料速度、珠子的直徑與用量、細胞濃度、冷卻溫度等.延長研磨時間、增加珠體的裝量、提高攪拌器轉速和操作溫度等都可有效地提高細胞破碎率，但高破碎率將使能耗大大增加．當破碎率超過80%時，將帶來的問題有：產(chǎn)生較多的熱能，增大了冷卻控溫的難度；大分子目的產(chǎn)物的失活損失增加；細胞碎片較小，分離碎片不易，給下一步操作帶來困難．因此，珠磨法的破碎率一般控制在80%以下．35常用的細胞破碎技術(二)高速勻漿法1.工作原理細胞懸浮液在高壓的作用下從閥座與閥之間的環(huán)隙高速噴出，每秒速度高達幾百米，高速噴出的漿液又射到靜止的撞擊環(huán)上，被迫改變方向從出口管流出。細胞在這一系列高速運動過程中經(jīng)歷了剪切、碰撞及由高壓到常壓的變化，從而造成細胞破碎。對于難破碎的和高濃度的細胞，常采用多次循環(huán)破碎的方法。36常用的細胞破碎技術(一)高速勻漿法1.工作原理37進口出口38394041常用的細胞破碎技術(二)高速勻漿法2.影響因素影響破碎的主要因素是壓力、溫度和通過勻漿器的次數(shù)．一般來說，增大壓力和增加破碎次數(shù)都可以提高破碎率，但當壓力增大到一定程度后對勻漿器的磨損較大．所以在工業(yè)生產(chǎn)中，通常采用的壓力為55-70MPa.42常用的細胞破碎技術(二)高速勻漿法3.細胞破碎率的評價

N0原始細胞數(shù)量和N經(jīng)t時間操作后保留下來的未損害完整細胞數(shù)量.

Y(%)=[(N0-Nt)/N0]×100直接計數(shù)法間接計數(shù)法:蛋白質含量測定

43常用的細胞破碎技術(二)高速勻漿法4.破碎機理與動力學機理：從高壓室（幾百個大氣壓）壓出的細胞懸浮液經(jīng)歷了高速造成的剪切，碰撞以及由高壓到常壓的變化，從而造成細胞破碎。44常用的細胞破碎技術(二)高速勻漿法4.破碎機理與動力學實質：利用壓力變化將細胞壁和膜撕裂，靠細胞內(nèi)的滲透壓，使其內(nèi)含物全部釋放出來。破碎程度的難易程度由細胞壁的機械強度決定。胞內(nèi)物質的釋放快慢由內(nèi)含在細胞內(nèi)所處理的位置所決定。此外，閥與閥之間的形狀，兩者之間的距離，操作壓力和循環(huán)次數(shù)等因素對破碎效果起著重要的作用。45鮮牛奶20Mpa以下;花色牛奶40Mpa以下;果汁飲料30Mpa以下;植物蛋白飲料45Mpa以下;有機顏料90Mpa以下;染料90Mpa以下;大腸桿菌60Mpa以下;酵母菌90Mpa以下;

脂肪乳100Mpa以下要得到1μm以下粒子若壓力須在100Mpa以上一般情況下，壓力越高，粒子越細越均勻，如一次均質不夠可進行多次均質.46常用的細胞破碎技術47常用的細胞破碎技術(二)高速勻漿法4.破碎機理與動力學

ln[1/(1-R)]=KNP

R為破碎率，即N次循環(huán)后蛋白質的釋放量Rn與最大釋放量Rm之比；K為與溫度有關的速度常數(shù)；N為懸浮液通過勻漿器的次數(shù)；P為操作壓力，MPa;與微生物種類有關。485.影響因素影響破碎的主要因素是壓力、溫度和通過勻漿器的次數(shù)．一般來說，增大壓力和增加破碎次數(shù)都可以提高破碎率，但當壓力增大到一定程度后對勻漿器的磨損較大．所以在工業(yè)生產(chǎn)中，通常采用的壓力為55-70MPa.49影響破碎的主要因素壓力：升高壓力有利于破碎，減少細胞破碎的循環(huán)次數(shù)。次數(shù)：盡可能避免細胞碎片過小，影響后續(xù)分離。溫度：避免蛋白質變性。破碎性能隨著菌體的種類和生長環(huán)境的不同而不同50其它因素

培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基（限制型和復合型），生長期（對數(shù)生長期，靜止期），稀釋率等因素勻對細胞破碎有影響。

溫控與能耗：機械破碎的能耗主要包括提供動力消耗的能量以及低溫操作耗費的能量。51

蛋白質和酶的失活主要由勻漿過程中的熱引起的。溫控在35℃以下，酶的損失可忽略。對于溫度敏感性物質，低溫操作是必需的，高壓勻漿一般需要多級操作，每次循環(huán)前往往進行級間冷卻。

提高壓力有利于細胞破碎，但提高壓力需要增加耗能，同時為移走產(chǎn)生的熱量需要付出代價。526.存在問題較易造成堵塞的團狀或絲狀真菌較小革蘭氏陽性菌亞細胞器質地堅硬，易損傷勻漿器不適合采用高壓勻漿法其他微生物細胞均適合采用高壓勻漿法破碎細胞53常用的細胞破碎技術(二)高速勻漿法7.常見高壓細胞破碎儀有實驗室級和生產(chǎn)型高壓細胞破碎儀.54實驗室級高壓均質儀55高壓細胞破碎機56

意大利NIROSOAVI實驗型高壓均質機是專門為實驗室應用設計的設備，用途廣泛，可用于實驗室細胞破碎，脂肪乳制備，脂質體制備，高壓均質乳化等。

57高壓勻漿法與高速珠磨法比較高壓勻漿法：操作參數(shù)少，易確定。需循環(huán)2-4次。高速珠磨法：兼有破碎和冷卻雙重功能。減少了產(chǎn)物失活的可能性。幾乎所有種類微生物細胞均可達到較高的破碎率。缺點：損失玻璃珠表層的破碎液（30%）。58復習

本章介紹的細胞破碎和固液分離操作屬于初級分離階段，它們主要影響產(chǎn)物的收率。59復習破碎方法機械法非機械法固體剪切力液體剪切力珠磨法壓榨干燥處理溶液作用高壓勻漿超聲破碎酶溶法化學法物理法細胞破碎技術的基本分類是否使用外加作用力60復習一：珠磨法61復習二：高速勻漿法62高壓勻漿法與高速珠磨法比較高壓勻漿法：操作參數(shù)少，易確定。需循環(huán)2-4次。高速珠磨法：兼有破碎和冷卻雙重功能。減少了產(chǎn)物失活的可能性。幾乎所有種類微生物細胞均可達到較高的破碎率。缺點：損失玻璃珠表層的破碎液（30%）。63常用的細胞破碎技術(三)超聲破碎法超聲破碎通常是聲頻高于15-20kHz的超聲波在高強度聲能輸入下可以進行細胞破碎，其工作原理尚未完全清楚,可能和空化現(xiàn)象引起的沖擊波和剪切力有關。空化現(xiàn)象是在超強聲波作用下，氣泡形成、長大和破碎的現(xiàn)象。646566常用的細胞破碎技術(三)超聲破碎法動力學方程對酵母菌超聲破碎的實驗結果進行分析和關聯(lián)，得出如下關系式：1-SP=exp(-KPT)1-SP=exp{-(P-P0)/]

}KP=[(P-P0)/]

KP=b’(P-P0)0.9

SP:蛋白質釋放率Kp:蛋白質釋放常數(shù)T：處理時間P：輸入功率P0:空化作用的最低功率67常用的細胞破碎技術(三)超聲破碎法超聲破碎的效率與聲頻、聲能、處理時間、細胞濃度及菌種類型等因素有關.輸出功率增大,破碎作用增強;細胞濃度低,有利于細胞破碎;采用短時多次超聲波輻射的工作方式有利于細胞破碎.一般地，桿菌比球菌較易破碎，革蘭氏陰性細菌比革蘭氏陽性細菌細胞較易破碎，對酵母菌的效果較差．68常用的細胞破碎技術(三)超聲破碎法存在問題超聲波所產(chǎn)生的化學自由基團能使某些敏感活性物質變性失活。噪聲難于忍受，大容量傳遞，散熱均有困難。處理樣品少及破碎時間較長。優(yōu)勢:應用較為普及，儀器設備廉價。69常用的細胞破碎技術(四)酶溶法利用酶反應，分解破壞細胞壁上的特殊鍵，從而達到破壁的目的。酶溶法可分為外加酶法和自溶法兩種．1.外加酶法常用：溶菌酶，葡聚糖酶，蛋白酶，甘露糖酶，糖苷酶，肽鏈內(nèi)切酶，殼多糖酶等.優(yōu)點：選擇性釋放產(chǎn)物，條件溫和，核酸泄出量少，細胞外形完整。缺點：價格高、通用性差、存在產(chǎn)物抑制.外加酶法主要用于實驗室規(guī)模，如利用酶溶法可從細胞內(nèi)不同位置選擇性地釋放目的產(chǎn)物和制取特殊的胞壁葡聚糖聚合物等．70常用的細胞破碎技術(四)酶溶法2.自溶法它是一種特殊的酶溶方式，其所需的溶胞酶是由微生物本身產(chǎn)生的．影響自溶過程的主要因素有溫度、時間、pH、激活劑和細胞代謝途徑等．微生物細胞的自溶法常采用加熱法和干燥法．自溶法的缺點是對不穩(wěn)定的微生物，易引起所需蛋白質的變性；此外，自溶后細胞懸浮液粘度增大，過濾速率下降．71常用的細胞破碎技術(五)化學滲透法某些有機溶劑(如苯和甲苯)、抗生素、表面活性劑(SDS、TritonX-100)、EDTA螯合劑、變性劑(鹽酸胍和脲)等,可以改變細胞壁或膜的通透性(滲透性),從而使胞內(nèi)物質有選擇地滲透出來,這就是化學滲透法.1.表面活性劑：對疏水性物質具有很強的親和力，能結合并溶解磷脂。其增溶作用有助于細胞的破碎。72常用的細胞破碎技術(五)化學滲透法2.EDTA螯合劑：通過螯合細胞膜上的金屬離子，破壞細胞膜的結構，增加細胞膜的通透性?？捎糜谔幚砀锾m氏陰性菌,它對其細胞外層膜有破壞作用.EDTA處理革蘭氏陰離子，對細胞外層膜有破壞作用。G-菌的外層膜結構通?？慷r陽離子Ca2+或Mg2+結合多糖和蛋白質來維持，一旦EDTA將Ca2+或Mg2+螯合，大量脂多糖分子將脫落，使外層膜出現(xiàn)洞穴，這些區(qū)域由內(nèi)層膜的磷脂來填補，導致該區(qū)域通透性增強.73常用的細胞破碎技術(五)化學滲透法3.有機溶劑：分解細胞壁中的脂質類物質，是細胞膜溶脹，進而細胞破碎。4.變性劑：一般認為變性劑與水中氫鍵作用，削弱溶質分子間的疏水作用，從而使疏水性化合物溶于水中。鹽酸胍和脲是常用的變性劑．鹽酸胍不僅能改變細胞通透性，而且能溶解不溶性重組蛋白，并在其他試劑的配合下使其二硫鍵斷裂，變性解離成亞基，從而釋放出來。74化學滲透法與機械法相比具有如下主要優(yōu)缺點優(yōu)點：對釋放產(chǎn)物有一定選擇性，例如：小分子多肽或小分子酶蛋白。用0.2ml/L

胍處理E.Coli1.5h后，80%β-內(nèi)酰胺酶釋放出來，而總的蛋白質僅釋放為4%。細胞外形保持完整，碎片少，有利于后分離。核酸釋放量少，漿液粘度低。缺點：時間長，效率低，化學試劑所產(chǎn)生的毒素及酶的修飾。選擇性75常用的細胞破碎技術(六)微波加熱法微波是頻率介于300MHz和300GHz之間的電磁波,微波加熱法是利用微波場中介質的偶極子轉向極化與界面極化的時間與微波頻率吻合的特點,促使介質轉動能級躍遷,加劇熱運動,將電能轉化為熱能.76常用的細胞破碎技術(六)微波加熱法從細胞破碎的微觀角度看,微波加熱導致細胞內(nèi)的極性物質,尤其是水分子,吸收微波能,產(chǎn)生大量的熱量,使胞內(nèi)溫度迅速上升,液態(tài)水汽化產(chǎn)生的壓力將細胞膜和細胞壁沖破,形成微小的孔洞;進一步加熱,導致細胞內(nèi)部和細胞壁水分減少,細胞收縮,表面出現(xiàn)裂紋.孔洞或裂紋的存在使胞外溶劑容易進入細胞內(nèi),溶解并釋放出胞內(nèi)產(chǎn)物.77常用的細胞破碎技術78將細胞放在高滲透壓的介質中（如一定濃度的甘油或蔗糖溶液），達平衡后，轉入到滲透壓低的緩沖液或純水中，由于滲透壓的突然變化，水迅速進入細胞內(nèi)，引起細胞溶脹，甚至破裂。（1）滲透壓沖擊法（Osmoticpressure）僅適用于細胞壁較脆弱的細胞或細胞壁預先用酶處理或在培養(yǎng)過程中加入某些抑制劑（如抗生素等），使細胞壁有缺陷，強度減弱。(七)其他方法79將細胞放在低溫下突然冷凍而在室溫下緩慢融化，反復多次而達到破壁作用。由于冷凍，一方面使細胞膜的疏水鍵結構破裂，另一方面胞內(nèi)水結晶，使細胞內(nèi)外溶液濃度變化，引起細胞膨脹而破裂。（2）反復凍融法適用于細胞壁較脆弱的菌體，破碎率較低，需反復多次，此外，在凍融過程中可能引起某些蛋白質變性。80使細胞結合水分喪失，從而改變細胞的滲透性。當采用丙酮、丁醇或緩沖液等對干燥細胞進行處理時，胞內(nèi)物質就容易被抽提出來。（3）干燥法氣流干燥真空干燥噴霧干燥冷凍干燥氣流干燥主要適用于酵母菌，一般在25～30℃的氣流中吹干；真空干燥多用于細菌；冷凍干燥適用于較不穩(wěn)定的物質。

81此法是將濃縮的菌體懸浮液冷卻至-25℃形成冰晶體，利用500MPa以上的高壓沖擊，使冷凍細胞從高壓閥小孔擠出，由于冰晶體的磨損，使包埋在冰中的微生物變形而破碎。（4）X-press法該法主要用于實驗室，具有使用范圍廣、破碎率高、細胞碎片粉碎程度低及活性保留率高等優(yōu)點。不適用于對冷凍敏感的物質。82三細胞破碎技術研究方向

（1）多種破碎方法相結合化學法與酶法取決于細胞壁的化學組成，機械法取