海洲灣鋼養(yǎng)殖牡蠣腹瀉性毒素監(jiān)測(cè)

海洲灣鋼養(yǎng)殖牡蠣腹瀉性毒素監(jiān)測(cè)

近年來(lái)，沿海水體的潮平面打破了水生生態(tài)平衡，限制了浮游生物和底棲生物之間的依賴(lài)關(guān)系，損害了生物食物鏈的正常循環(huán)。赤潮生物體內(nèi)或代謝產(chǎn)物中含有生物毒素，不僅直接毒死魚(yú)、蝦等生物，而且赤潮毒素通過(guò)食物鏈的傳遞，危害人類(lèi)的健康。常見(jiàn)赤潮毒素有5類(lèi)：麻痹性貝毒（Paralyticshellfishporsonmg,PSP）、神經(jīng)性貝毒（Neurotoxicshellfishpoisoning,NSP）、腹瀉性貝毒（DiarrheticShellfishPoisons,DSP）、記憶缺失性貝毒（Amnesicshellfishpoisoning,NSP）和西加魚(yú)毒（Cigusterafishpoisoning,CFP），其中以麻痹性貝毒和腹瀉性貝毒在世界范圍內(nèi)分布廣、危害大而受到重視。腹瀉性貝毒素（DiarrheticShellfishPoisons,DSP）是一種脂溶性毒素，被人食用后產(chǎn)生以腹瀉為特征的中毒效應(yīng)。目前已發(fā)現(xiàn)的腹瀉性貝類(lèi)毒素大致可分為3類(lèi)：軟海綿酸（Okadaicacid,OA）及其衍生物鰭藻毒素（DTX）、大環(huán)內(nèi)脂扇貝毒素（PTX）和磺化毒素（YTX）及其衍生物。毒素的檢測(cè)分析方法主要有生物分析法、細(xì)胞毒性分析、免疫分析和化學(xué)分離法。免疫分析包括放射免疫分析（RIA）和酶聯(lián)免疫分析（ELISA），具有選擇性高、靈敏度好、專(zhuān)一性強(qiáng)的特點(diǎn)。試驗(yàn)選擇酶聯(lián)免疫分析方法，通過(guò)比較2010—2012年海洲灣海域赤潮監(jiān)控區(qū)、增養(yǎng)殖區(qū)、趨勢(shì)性監(jiān)測(cè)區(qū)牡蠣腹瀉性毒素檢測(cè)結(jié)果，探討酶聯(lián)免疫法在貝毒檢測(cè)中的實(shí)際效果，以及貝毒與有毒赤潮的相關(guān)性應(yīng)用。1材料和方法1.1均質(zhì)物的制備樣品采集于2010、2011、2012年海洲灣海域赤潮監(jiān)控區(qū)、增養(yǎng)殖區(qū)、趨勢(shì)性監(jiān)測(cè)區(qū)的新鮮牡蠣。經(jīng)洗凈、瀝干、去殼后，取可食部分用高速勻漿機(jī)制成均質(zhì)物，備用。腹瀉性貝毒標(biāo)準(zhǔn)品為伊普瑞斯科技有限公司E-OA-C100型。岡田軟海綿酸檢測(cè)試劑盒為荷蘭EURO-PROXIMA公司產(chǎn)品，試劑盒為96微孔板，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度分別為0,0.2,0.5,1.0,2.0,5.0,10.0ng/mL。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。甲醇為美國(guó)天地公司色譜純（100%）。檢測(cè)酶標(biāo)儀為美國(guó)伯樂(lè)公司Bio-rad680型。1.2清液的制備稱(chēng)取1.0g檢測(cè)樣品均質(zhì)物，加入1.0mL超純水，渦旋混合1min，加甲醇2.0mL，渦旋混合1min,2000r/min離心10min。收集上清液，0.45μm濾膜過(guò)濾。濾液用樣品稀釋緩沖液50倍稀釋?zhuān)浞只靹蚝笪?0μL為樣品檢測(cè)液。1.3檢測(cè)樣品前處理微孔板從上到下依次設(shè)置為A～H,A為空白，B～H為標(biāo)準(zhǔn)溶液系列濃度。A孔加零標(biāo)準(zhǔn)溶液100μL,B～H孔依次加標(biāo)準(zhǔn)溶液50μL，濃度分別為0,0.2,0.5,1.0,2.0,5.0,10.0ng/mL，分別加入酶結(jié)合物溶液25μL和抗體溶液25μL。其余各孔分別為經(jīng)過(guò)前處理的牡蠣檢測(cè)樣品。所有標(biāo)準(zhǔn)溶液和檢測(cè)樣品均同時(shí)設(shè)平行組2個(gè)。薄膜封板，搖板1min，室溫20～25℃，暗處溫育30min。棄去孔中的液體，用洗滌緩沖液沖洗板孔，吸水紙上拍干，重復(fù)3次。各孔分別加底物溶液100μL，室溫20～25℃，暗處溫育15min。再加入終止液100μL。以空氣為空白，酶標(biāo)儀450nm處讀取吸光值。1.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的吸光值減去空白值，結(jié)果除以零標(biāo)準(zhǔn)吸光值，再乘以100。以得到的系列比值為Y軸，X軸上的濃度對(duì)數(shù)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，在0.2～10.0ng/mL范圍成線性。利用試劑盒公司提供的數(shù)據(jù)分析軟件繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，并乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算出各個(gè)樣品的腹瀉性毒素濃度。1.5貝毒標(biāo)樣的檢測(cè)檢測(cè)樣品中分別添加濃度為1.0,3.0和5.0μg/kg腹瀉性貝毒標(biāo)樣。按照樣品的前處理方法同時(shí)進(jìn)行前處理，測(cè)定腹瀉性貝毒的含量，計(jì)算回收率。每隔10d，進(jìn)行3個(gè)批次樣品的處理和測(cè)定，并計(jì)算回收率。2結(jié)果2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線直線方程y=a+bln(x），其中a=64.7,b=-20.28。相關(guān)系數(shù)R2=0.9914（圖1）。2.2不同時(shí)期牡蠣腹瀉性毒素含量比較2010年赤潮監(jiān)控區(qū)、增養(yǎng)殖區(qū)和趨勢(shì)性監(jiān)測(cè)區(qū)牡蠣腹瀉性毒素含量分別為20.9～74.5μg/kg,21.3～34.8μg/kg和30.1～39.8μg/kg，以趨勢(shì)性監(jiān)測(cè)區(qū)為最高。3個(gè)不同監(jiān)測(cè)區(qū)的檢出率分別為83.3%，83.3%和80.0%，9月份檢出率高于8月份（表1）。2011年赤潮監(jiān)控區(qū)、增養(yǎng)殖區(qū)和趨勢(shì)性監(jiān)測(cè)區(qū)的牡蠣腹瀉性毒素含量分別為25.3～50.6μg/kg,20.6～52.5μg/kg和30.1～39.8μg/kg，以赤潮監(jiān)控區(qū)為最高。3個(gè)不同檢測(cè)區(qū)的檢出率分別為100.0%，50.0%和50.0%，8月份的檢出率高于5月份（表2）。2012年赤潮監(jiān)控區(qū)牡蠣腹瀉性毒素含量為15.8～35.6μg/kg，檢出率為66.7%。增養(yǎng)殖區(qū)牡蠣腹瀉性毒素含量未檢出（表3）。2.3回收率及批內(nèi)變異系數(shù)腹瀉性貝毒以1.0,3.0和5.0μg/kg在檢測(cè)樣品添加后，平均回收率分別達(dá)到88.0%，86.7%和88.6%。批內(nèi)變異系數(shù)分別為1.60%～2.46%，1.81%～2.66%和1.44%～4.60%。批間變異系數(shù)分別為3.38%，3.08%和3.98%。3減少牡蠣腹瀉性毒素，降低赤潮放出率，減輕企業(yè)回收率赤潮是一種海洋災(zāi)害，已引起沿海國(guó)家的高度重視，嚴(yán)格控制污水和污染物的入海量是比較有效的防治措施。赤潮對(duì)生物資源的影響已成為聯(lián)合國(guó)有關(guān)組織所關(guān)注的全球性問(wèn)題之一。在防范赤潮工作方面，建立了赤潮防治和監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，對(duì)有跡象出現(xiàn)赤潮的海區(qū)，進(jìn)行連續(xù)的跟蹤監(jiān)測(cè)，及時(shí)掌握引發(fā)赤潮環(huán)境因素的動(dòng)向，為預(yù)報(bào)赤潮的發(fā)生提供信息，對(duì)發(fā)生赤潮的海區(qū)采取必要的防范措施。2010—2012年，在海洲灣海域赤潮監(jiān)控區(qū)、增養(yǎng)殖區(qū)和趨勢(shì)性監(jiān)測(cè)區(qū)共檢測(cè)42個(gè)養(yǎng)殖牡蠣樣品的腹瀉性毒素。腹瀉性毒素含量由2010年的20.9～74.5μg/kg，逐漸降低到2011年至20.3～52.5μg/kg和2012年的15.8～35.6μg/kg。連續(xù)3年養(yǎng)殖牡蠣檢測(cè)樣品中腹瀉性毒素平均檢出率分別為82.4%、66.7%和57.1%。從養(yǎng)殖牡蠣檢測(cè)樣品中腹瀉性毒素含量和檢測(cè)率逐漸降低的情況分析，加強(qiáng)海洋環(huán)境保護(hù)，控制沿海廢水廢物的入海量，特別要控制氮、磷和其他有機(jī)物的排放量，對(duì)控制赤潮的發(fā)生起到了一定的效果。應(yīng)用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)養(yǎng)殖牡蠣腹瀉性貝