黃病毒屬flaviviris的研究進展

黃病毒屬flaviviris的研究進展

病毒屬（flaviri）是黃毒科（flaviri）的最大家族，分為8個血清學(xué)亞組，包括登革病毒（denv）、乙腦病毒性腦炎（jv）、蠕蟲傳播腦炎（tv）、硫醇酯病毒（tv）、卡其色病毒（wnv）、kun列寧病毒（kun）和黃熱病毒（yev）。大多數(shù)病毒是通過蚊子、蚊子和其他媒體傳播的害蟲媒體病毒。所引起的疾病以出血熱和病毒性腦炎危害最大,常導(dǎo)致嚴重的公共衛(wèi)生問題。我國目前已發(fā)現(xiàn)的黃病毒有乙型腦炎病毒,4個血清型登革病毒和蜱傳腦炎病毒等。由于近二十年來全球氣候變暖、國際交流頻繁以及缺乏對蚊蟲的有效控制措施等造成黃病毒感染有擴大趨勢,每年登革病毒的感染人數(shù)近百萬,西尼羅病毒的流行也引起較高的發(fā)病率和死亡率。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,從基因組結(jié)構(gòu)與功能方面探索黃病毒致病機制的研究也逐漸深入。黃病毒為有包膜的單股正鏈RNA病毒,基因組全長約11kb,編碼長度3000~3500個氨基酸殘基的多聚蛋白前體,依次為5′-C-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-3′。前體蛋白在宿主信號肽酶和病毒絲氨酸蛋白酶的催化下切割成為3種結(jié)構(gòu)蛋白(C,PrM和E)和7種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1,NS2A,NS2B,NS3,NS4A,NS4B和NS5)。5′非編碼區(qū)(untranslatedregions,UTR)長約100個核苷酸,有m7GpppG帽子結(jié)構(gòu)。3′UTR長400~800個核苷酸,但無poly(A)結(jié)構(gòu)。黃病毒非編碼區(qū)具有高度保守性,在病毒的復(fù)制與翻譯中起重要作用,一直是研究者關(guān)注的領(lǐng)域,本文就黃病毒非編碼區(qū)的最新研究進展作一簡要綜述。1穩(wěn)定的rna合成及復(fù)制黃病毒基因組非編碼區(qū)包括幾個保守的序列和二級結(jié)構(gòu),涉及病毒復(fù)制與翻譯的調(diào)節(jié)。5′UTR包括二級莖環(huán)結(jié)構(gòu)(stem-loop,SL)A、B及與3′UTR互補的環(huán)化序列(complementcyclizationsequence,cCS),3′非編碼區(qū)有SL、環(huán)化序列(cyclizationsequence,CS)1、高度保守序列(conservedsequence,CS)2、串聯(lián)重復(fù)序列(repeatedconservedsequence,RCS)2、CS3、RCS3和可變區(qū)(variableregion,VR)等對復(fù)制和翻譯有重要作用的RNA元件。不同黃病毒3′UTR的串聯(lián)重復(fù)序列有所不同。登革病毒的3′UTR僅包括CS1、CS2、RCS2元件,而JE、WN和MVE的3′UTR還有CS3與RCS3。YF的3′UTR則無RCS2、CS3和RCS3,僅包含一段3個串聯(lián)的重復(fù)序列。黃病毒5′UTR具有高度保守性。比較YF,MVE,WNV和DEN的5′UTR,發(fā)現(xiàn)其二級結(jié)構(gòu)不僅具有相似的大小、形狀和熱力學(xué)性質(zhì),而且折疊后的莖環(huán)結(jié)構(gòu)也是相似的SLA及SLB。這個保守的二級結(jié)構(gòu)可能在病毒復(fù)制中起重要作用。關(guān)于負鏈RNA合成的最新機制也證明了SLA在病毒基因組環(huán)化中具有不可替代作用?；蚪M5′末端最保守的序列是位于SLB下游與3′UTR環(huán)化序列相應(yīng)的互補序列5′cCS。5′和3′末端序列的堿基配對使得正鏈RNA在復(fù)制早期可形成環(huán)化構(gòu)象。這種構(gòu)象使病毒復(fù)制酶同時結(jié)合于模板RNA的兩個末端,以確保產(chǎn)生全長序列的子代RNA。對于蚊媒病毒基因組,5′cCS有8個nt,在KUN病毒位于5′末端+137~+144,在ORF內(nèi)AUG下游34~40nt。對于TBE,5′cCS分為C1和C2。TBE的5′UTR內(nèi)包括1個很短的ORF,其終止子也在5′UTR內(nèi)。C1位于這個小ORF下游+115~+125,完全在5′UTR內(nèi)。C2在C1下游,共11nt,位于真正的ORF內(nèi),與蚊媒黃病毒5′cCS位置類似。蚊媒黃病毒3′UTR內(nèi)的3′CS有8nt,位于3′SL上游處CS1內(nèi),在蚊媒黃病毒是半保守的。TBE的C1在3′UTR的互補序列位于3′SL上游-81~-71,與C2互補的序列位于-184~-193。有報道指出,蚊媒黃病毒可能需要另外的非保守核酸序列(5′cCS上游富含嘧啶區(qū)與3′CS下游富含嘌呤區(qū))進一步穩(wěn)定5′和3′CS構(gòu)成的鍋柄狀結(jié)構(gòu)。Alvarez通過原子力學(xué)顯微鏡證實了這個預(yù)測,認為除上述CS外,DEN非編碼區(qū)存在另一互補的環(huán)化序列(由于位于5′AUG啟動子上游和3′SL的莖部稱為5′和3′upstreamAUGregion,UAR),并經(jīng)全長感染性cDNA克隆分析證明此序列是病毒基因組環(huán)化和復(fù)制所必需的。當缺失UAR時,僅有5′和3′CS不足以實現(xiàn)體外RNA-RNA復(fù)合物的環(huán)化。在CS或UAR內(nèi)逐一改變單個核苷酸破壞互補性,對于鍋柄狀構(gòu)象的穩(wěn)態(tài)影響很大;而同時突變這些位點并保持其互補性,則對RNA的復(fù)制影響不大。這表明兩個互補序列的相互作用對于穩(wěn)定RNA-RNA構(gòu)象很重要。由于黃病毒非編碼區(qū)的高度保守性,其他蟲媒黃病毒的RNA環(huán)化可能也存在CS與UAR。但對于黃病毒復(fù)制,僅有環(huán)化序列是遠遠不夠的,因為在宿主細胞內(nèi),很可能還有病毒和細胞蛋白參與調(diào)節(jié)RNA構(gòu)象和穩(wěn)定環(huán)化狀態(tài)。黃病毒3′UTR的第二個保守序列CS2被重復(fù)稱為RCS2。西尼羅病毒的CS2和RCS2被證明參與調(diào)節(jié)RNA的合成。Lo構(gòu)建了可對病毒復(fù)制與翻譯過程分別進行定量的復(fù)制子系統(tǒng),并對WNV3′UTR保守序列元件進行功能分析。在此系統(tǒng)中,缺失突變WNV3′UTR中CS1序列明顯抑制復(fù)制,分別缺失CS2、RCS2、CS3和RCS3后,復(fù)制子仍有活力但RNA的量大大減少。作者認為WNV基因組5′cCS-3′CS1的環(huán)化是RNA復(fù)制的關(guān)鍵因素,CS2、RCS2、CS3和RCS3可以促進復(fù)制但不是必需的。黃病毒3′UTR還包括幾個保守的二級結(jié)構(gòu),位于3′CS上游的假結(jié)PKⅡA和PKⅡB以及緊靠3′CS下游的末端莖環(huán)區(qū)3′SL。DEN和JEV基因組的假結(jié)具有重復(fù)序列,并且被保守的CS2和RCS2環(huán)繞。YFV的假結(jié)僅包括1個CS2,沒有重復(fù)序列。TBE采用1個特殊的二級結(jié)構(gòu)替代了這個保守的假結(jié)。蚊媒黃病毒保守的假結(jié)構(gòu)象提示其進化關(guān)系更親密。此外,3′SL包含一個在黃病毒高度保守的5nt環(huán),參與調(diào)節(jié)RNA合成。Tilgner利用上述WNV復(fù)制子對3′UTR進行系統(tǒng)缺失突變,發(fā)現(xiàn)位于基因組3′SL頂部閉合環(huán)內(nèi)有一個5nt(5′-CACAG-3′)序列,該序列及其位置在蚊媒黃病毒和TBE相當保守。在病毒復(fù)制時要求特殊的序列和結(jié)構(gòu):位于5nt第1位的堿基對于復(fù)制很重要,第2、3和5位堿基的保守性是RNA合成的關(guān)鍵,緊靠其下游的U(黃病毒屬部分病毒保守)不是病毒復(fù)制必需的。其功能不明,可能與病毒RNA復(fù)制時介導(dǎo)細胞或病毒蛋白結(jié)合于3′SL有關(guān)。2den負鏈作用病毒感染機體后,正鏈RNA病毒基因組指導(dǎo)與病毒復(fù)制有關(guān)的蛋白合成。一旦合成了病毒多聚酶和一些關(guān)鍵蛋白,病毒RNA就從3′末開始合成一條互補的負鏈。同樣,再以其為模板合成一條新的正鏈。正鏈和負鏈模板中存在調(diào)控RNA合成時機、水平和極性的元件,包括結(jié)合RNA依賴的RNA聚合酶(RNAdependentRNApolymeraes,RdRp)的啟動子、調(diào)節(jié)RdRp接近起始位點的增強子和抑制子。黃病毒3′SL是病毒復(fù)制必不可少的,Tilgner和Elghonemy構(gòu)建的WNV復(fù)制子系統(tǒng)證明,缺失3′SL后72h病毒RNA的復(fù)制僅為野毒的0.02%。另一些RNA元件CS1和UAR,也是復(fù)制關(guān)鍵序列。DEN、WNV、KUN和YFV的RNA復(fù)制均要求5′和3′末端RNA相互作用。啟動子通常位于正鏈/負鏈RNA的3′端,但5′末端及編碼區(qū)也發(fā)現(xiàn)有順式作用的RNA結(jié)構(gòu)。Filomatori分別缺失突變DEN復(fù)制子5′SLA、SLB和5′CS,發(fā)現(xiàn)當SLA完整時5′和3′相互作用可以提高RNA的合成。據(jù)此提出DEN負鏈合成的新模式:病毒編碼的RdRp識別并結(jié)合于病毒RNA的5′末端,通過5′和3′末端RNA之間大范圍的相互作用,基因組5′啟動子與3′UTR在空間位置上接近,便于病毒多聚酶到達3′末端開始RNA合成。而且,啟動子位于5′末端還與DENV等蚊媒病毒復(fù)制時5′和3′末端大范圍RNA相互作用的發(fā)現(xiàn)相應(yīng)。DEN5′和3′末端相互作用的二級結(jié)構(gòu)模式表明:當3′SL上半部分保持莖環(huán)結(jié)構(gòu)不變時,下半部分打開,與5′端互補序列結(jié)合,即UAR區(qū)。此模式也解釋了5′和3′UAR的相互作用在RNA合成時對3′SL結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)。最近Kofler報道了TBE復(fù)制時一個新的重要互補序列,該序列位于AUG上游及3′SL底部,類似于的DEN5′和3′UAR,從而為蚊媒和蜱媒黃病毒在RNA復(fù)制時3′SL周圍的結(jié)構(gòu)變化提供了證據(jù)。病毒RNA合成時其基因組環(huán)化有幾個優(yōu)點:保證以全長序列作為模板進行復(fù)制;基因組5′和3′的信號重疊便于復(fù)制與翻譯的相互協(xié)調(diào);提高RNA的穩(wěn)定性;利于病毒RdRp和復(fù)制復(fù)合體接近相應(yīng)位點;便于控制負鏈RNA的合成。原子力學(xué)顯微鏡下可直接看到并證實病毒基因組環(huán)化是CS和UAR相互作用的直接結(jié)果。對環(huán)化序列進行點突變可造成病毒的致死性改變,說明環(huán)化序列對病毒基因組的重要性。還有一些研究采用不同的方法得出類似的結(jié)果。為了便于觀察非編碼區(qū)RNA元件的順式作用,許多研究以磷酸二酰胺嗎啉代寡聚體(phosphorodiamidatemorpholinooligomers,PMO)為工具屏蔽相應(yīng)功能元件,觀察對病毒復(fù)制和翻譯的影響。PMO是由磷酸二酰胺將嗎啉代環(huán)狀亞基串聯(lián)而成的由18~25個堿基組成的DNA樣寡聚體,通過Waston-Crick堿基配對原則與靶序列互補。PMO的水溶性使其可與RNA以穩(wěn)定的序列特異的方式結(jié)合,而不誘導(dǎo)RNaseH的降解。PMO的5′端連接一段富含精氨酸的短肽可使其被培養(yǎng)細胞有效攝入。Deas根據(jù)WNV復(fù)制子設(shè)計特異性PMO抑制重要的順式作用元件,發(fā)現(xiàn)針對3′CS的PMO隨著其濃度增多,感染后24h病毒滴度下降最快,說明PMO可以封閉環(huán)化序列,同時也說明阻止基因組環(huán)化抑制了病毒增殖。Holden針對DEN復(fù)制子3′CS設(shè)計的PMO抑制了病毒復(fù)制但不影響翻譯,針對3′SL頂環(huán)設(shè)計的PMO既抑制病毒復(fù)制也抑制其翻譯,說明3′CS和3′SL參與DEN復(fù)制與翻譯的調(diào)控,PMO可能成為抗病毒藥物。3核心網(wǎng)絡(luò)中間級的結(jié)構(gòu)-3ut正鏈RNA病毒基因組進入宿主細胞,在胞質(zhì)內(nèi)至少參與三個過程:作為mRNA翻譯病毒蛋白;作為模板合成正鏈負鏈RNA以及后期作為子代正鏈RNA在病毒組裝時被結(jié)構(gòu)蛋白包裝。目前,對于病毒生活周期中各階段病毒RNA如何被利用的確切分子機制并不清楚,但還是有一些證據(jù)揭示了其增殖過程。由于蛋白質(zhì)合成的復(fù)雜性,病毒不可能編碼翻譯必需的所有成分。YFV、DEN和WNV感染真核細胞后,進行帽子依賴的翻譯機制:經(jīng)帽子結(jié)合蛋白eIF4E調(diào)節(jié),帽子結(jié)合復(fù)合物eIF4F識別mRNA5′末端m7GpppN-cap結(jié)構(gòu)。eIF4F由幾個因子組成:eIF4E、輔助因子eIF4G、解旋酶eIF4A和協(xié)同作用因子eIF4B。在細胞內(nèi),起始因子MettRNA/eIF2-GTP、eIF3和eIF1A與40S核糖體小亞基形成43S翻譯前復(fù)合物。隨后只有當eIF4F復(fù)合物與帽子結(jié)構(gòu)結(jié)合后,才能經(jīng)eIF3因子介導(dǎo)與43S核糖體復(fù)合物形成48S復(fù)合物。該復(fù)合物沿mRNA移動直到遇到翻譯起始密碼子AUG,隨后釋放所有起始因子,與60S核糖體大亞基形成80S核糖體,進入翻譯延伸階段。另一翻譯起始機制與核糖體內(nèi)部進入位點(IRES)有關(guān),后者引導(dǎo)43S越過AUG上游序列,直接進入起始密碼子附近。不同的IRES要求不同的翻譯起始因子,如eIF4G、eIF4A和eIF3。但登革病毒的翻譯與IRES無關(guān)。Edgil采用針對起始因子eIF4E的siRNA抑制其表達后,發(fā)現(xiàn)細胞翻譯受到抑制而DEN的翻譯不受影響。進一步抑制其他翻譯起始因子,發(fā)現(xiàn)DEN可以采用經(jīng)典的帽子依賴機制,也可以經(jīng)不需m7G帽子的非經(jīng)典機制起始翻譯。非經(jīng)典機制不被IRES調(diào)節(jié),但需要5′和3′UTR的相互作用。在宿主細胞內(nèi),為了獲得有限的翻譯起始因子,依賴帽子翻譯的病毒進化成多種機制競爭eIF4F的組分。登革病毒通過基因組5′和3′末端相互作用的方式比細胞內(nèi)其他依賴帽子的mRNA更加有效地競爭起始因子。因此,靶向3′CS的PMO才能有效抑制翻譯效率。5′帽子和3′poly(A)尾的相互作用是大多數(shù)細胞內(nèi)mRNA有效翻譯的保證。DEN和WNV等黃病毒3′末端沒有多聚腺苷酸化,但3′UTR的保守區(qū)域具有類似的作用。Holden構(gòu)建的DEN復(fù)制子表明3′UTR可以刺激翻譯,其中3′SL的作用占50%。除了3′SL,3′UTR的其他序列元件也參與病毒的復(fù)制和翻譯,可能3′UTR既參與RNA合成也調(diào)節(jié)病毒翻譯。Edgil比對了造成3株DEN2在人干細胞、BHK和C6/36細胞中增殖差異的分子基礎(chǔ),發(fā)現(xiàn)翻譯效率低的尼加拉瓜株3′UTR的序列較特殊,使用其3′UTR構(gòu)建的嵌合復(fù)制子同樣影響病毒翻譯效率,不過作者并未深入細化有功能