硝酸酯類(lèi)no供體oa雜合物的合成及抗肝炎藥物

硝酸酯類(lèi)no供體oa雜合物的合成及抗肝炎藥物

齊墩酸是一門(mén)廣泛分布于植物表面的三級(jí)化合物。它具有多種生物活性。臨床主要用于治療肝炎、肝硬化和其他慢性肝病，且治療劑量沒(méi)有明顯副作用。研究發(fā)現(xiàn),OA給藥后主要在肝臟分布、代謝。一氧化氮(NO)在體內(nèi)由NO合酶(NOS)催化氧化L-精氨酸生成。NO作為信使物質(zhì)或效應(yīng)分子在體內(nèi)發(fā)揮重要的生理功能。NO生成不足或NO信號(hào)傳導(dǎo)異常與多種疾病的形成和發(fā)展密切相關(guān),因此,外源性地補(bǔ)充N(xiāo)O、恢復(fù)NO正常信號(hào)傳導(dǎo)的策略使NO供體及其相關(guān)藥物應(yīng)運(yùn)而生。研究還發(fā)現(xiàn),NO在細(xì)胞凋亡過(guò)程中具有雙向調(diào)節(jié)作用:體內(nèi)持續(xù)低濃度的NO(無(wú)論是內(nèi)源性的還是外源性的)可抑制細(xì)胞凋亡,對(duì)細(xì)胞具有保護(hù)和促其生長(zhǎng)的作用;體內(nèi)高濃度的NO可產(chǎn)生細(xì)胞毒性,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,阻止腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移。門(mén)靜脈高壓是慢性肝炎的常見(jiàn)并發(fā)癥,也是肝硬化病人死亡的主要原因。病理研究發(fā)現(xiàn)其形成原因是:內(nèi)皮NO合酶的酶促反應(yīng)減弱,導(dǎo)致肝臟內(nèi)NO生成量不足,引起肝星狀細(xì)胞異常收縮。傳統(tǒng)硝酸酯類(lèi)血管舒張劑可降低門(mén)靜脈高壓,但其系統(tǒng)性擴(kuò)張血管的作用對(duì)肝炎病人危害較大。因而,如特異性地向肝臟釋放NO,而不影響系統(tǒng)的血壓,可能是治療此類(lèi)肝病的理想方法。Fiorucci等選擇熊去氧膽酸(UDCA)為先導(dǎo)化合物,將硝酸酯類(lèi)NO供體通過(guò)阿魏酸與UDCA偶連,設(shè)計(jì)合成了其N(xiāo)O釋放型熊去氧膽酸衍生物NCX-1000(圖1)。研究發(fā)現(xiàn)NCX-1000能選擇性地在肝臟釋放NO,在動(dòng)物肝損傷模型中發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡的作用,能阻止肝腹水形成,降低門(mén)脈壓。受此啟發(fā),作者曾以對(duì)肝組織具有高度親和力的OA為先導(dǎo)物,將硝酸酯類(lèi)NO供體經(jīng)抗氧連接基團(tuán)與OA28-COOH相連,設(shè)計(jì)合成了一系列結(jié)構(gòu)新穎的NO-OA雜合衍生物。初步生物活性研究顯示,此類(lèi)衍生物可釋放母體藥物OA及低濃度的NO,抑制肝細(xì)胞凋亡,發(fā)揮兩者的協(xié)同保肝活性,其中化合物ZCII2(圖1)的活性最強(qiáng)。為深入探討NO供體與OA不同位置偶聯(lián)對(duì)保肝活性的影響,并進(jìn)一步研究此類(lèi)化合物的構(gòu)效關(guān)系,尋找新型抗肝炎藥物。本文在前期研究基礎(chǔ)上,分別選取含香草酸(2,vanillicacid)、阿魏酸(ferulicacid)及對(duì)羥基桂皮酸(p-hydroxycinnamicacid)等抗氧劑的連接基團(tuán),通過(guò)它們將硝酸酯類(lèi)NO供體與OA的3位OH偶聯(lián),設(shè)計(jì)合成了10個(gè)衍生物10a、10b、11a~11e和12a~12c,并進(jìn)行了相關(guān)生物活性篩選。結(jié)果與討論1中間體3、3b、3a4e及55以香草醛(vanillin)為原料,經(jīng)氫氧化銀氧化得香草酸鈉1,酸化得香草酸2。香草酸、阿魏酸及對(duì)羥基桂皮酸分別與相應(yīng)的二溴烷烴或二溴烯烴反應(yīng)得重要的溴代有機(jī)酚酸酯類(lèi)中間體3a、3b、4a~4e及5a~5c,見(jiàn)合成路線1。OA在4-N,N-二甲氨基吡啶(DMAP)催化下與琥珀酸酐反應(yīng),得3-O-琥珀酸單酰化衍生物6,6分別與上述中間體3a、3b、4a~4e及5a~5c在二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、DMAP催化下進(jìn)行酯化反應(yīng),得產(chǎn)物7a、7b、8a~8e及9a~9c,最后在避光條件下與硝酸銀反應(yīng)分別得目標(biāo)化合物10a、10b、11a~11e及12a~12c(合成路線2)。所有目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)均經(jīng)IR、MS和1HNMR確證,其熔點(diǎn)、元素分析及圖譜數(shù)據(jù)見(jiàn)表1和表2。2藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果2.1整體研究結(jié)果采用LDH法,以母體藥物OA及NCX-1000為陽(yáng)性對(duì)照測(cè)試了所有目標(biāo)物抗Fas介導(dǎo)的HepG2細(xì)胞凋亡活性,結(jié)果見(jiàn)圖2。初步研究結(jié)果顯示,OA在測(cè)試條件下難以抑制HepG2細(xì)胞凋亡;而NCX-1000,在1×10-6mol·L-1濃度下可以保護(hù)33.4%的HepG2細(xì)胞使其免于抗Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,此結(jié)果與之前的報(bào)道一致;受試的目標(biāo)化合物中,12a顯示較強(qiáng)的細(xì)胞保護(hù)作用,其活性與NCX-1000相當(dāng),提示此作用可能與NO釋放有關(guān)。2.2a和ncx-400在不同時(shí)間下的o釋放率為進(jìn)一步研究活性化合物12a的作用機(jī)制,采用Griess試劑法,測(cè)定了12a及陽(yáng)性對(duì)照NCX-1000的體外NO釋放情況。如圖3所示,12a及NCX-1000在300min時(shí)分別達(dá)到最大值29ng·mL-1和28ng·mL-1,二者結(jié)果相近。相同實(shí)驗(yàn)條件下ZCII2的NO最大釋放量為12ng·mL-1而具有明顯抗腫瘤活性的呋咱氮氧化物(furoxan)類(lèi)NO供體型OA衍生物ZCVI4的NO最大釋放量達(dá)60ng·mL-1。3抗fas抑制劑活性由于與正常肝細(xì)胞具有相同的生物學(xué)活性,HepG2人肝腫瘤細(xì)胞株廣泛應(yīng)用于遺傳毒理學(xué)及病毒培養(yǎng)等方面研究肝病的發(fā)病機(jī)制。因此,在體外活性檢測(cè)中采用HepG2細(xì)胞作為本文的肝病研究模型。Fas分子被稱為“死亡分子”,其表達(dá)強(qiáng)度與肝細(xì)胞的損傷程度有密切的關(guān)系。Fas分子系統(tǒng)作為目前肝病領(lǐng)域新的研究熱點(diǎn),進(jìn)展十分迅速。大量的研究結(jié)果顯示Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與病毒性肝炎引起的肝損害密切相關(guān),抑制肝細(xì)胞Fas表達(dá)將有助于減輕肝細(xì)胞損傷的程度。本文采用LDH法,測(cè)試了所有目標(biāo)化合物抗Fas介導(dǎo)的HepG2細(xì)胞凋亡活性,與陽(yáng)性對(duì)照NCX-1000類(lèi)似,化合物12a顯示較強(qiáng)的抑制HepG2細(xì)胞凋亡作用,而相同條件下OA未見(jiàn)此作用;進(jìn)一步的體外NO釋放測(cè)試結(jié)果提示,12a及NCX-1000抑制細(xì)胞凋亡活性可能與釋放較低濃度的NO有關(guān)。與此形成鮮明對(duì)照的是,具有較強(qiáng)抗腫瘤活性的呋咱氮氧化物類(lèi)NO供體型OA衍生物ZCVI4,在相同實(shí)驗(yàn)條件下,體外可釋放高濃度的NO(約為12a及ZCII2的2~5倍)。這些初步研究結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了NO在細(xì)胞凋亡中的雙向調(diào)節(jié)作用,即低濃度的NO可抑制細(xì)胞凋亡,具有保護(hù)細(xì)胞的作用;而高濃度的NO,則具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。初步構(gòu)效關(guān)系分析可知:對(duì)于硝酸酯類(lèi)NO-OA雜合物,連接基團(tuán)及硝酸酯偶聯(lián)位置對(duì)其抑制HepG2細(xì)胞凋亡活性有較大影響,含有抗氧連接基團(tuán)的衍生物一般具有較強(qiáng)的細(xì)胞保護(hù)作用。但總體來(lái)說(shuō),與先前的研究結(jié)果比較,同樣均含抗氧連接基團(tuán),本文所合成的OA的3-OH硝酸酯偶聯(lián)物除12a外總體活性弱于OA的28-COOH硝酸酯偶聯(lián)物(如ZCII2);而相同碳鏈長(zhǎng)度的連接基團(tuán),含烯烴的衍生物活性較強(qiáng)(11e>11c)。此類(lèi)新型NO-OA雜合物的體內(nèi)活性及作用機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。光譜及元素分析熔點(diǎn)用毛細(xì)管法測(cè)定(溫度未校正),IR譜用NicoletImpact410型傅里葉變換紅外光譜儀測(cè)定(KBr壓片法);1HNMR用BrukerAMX-300型核磁共振儀測(cè)定(TMS為內(nèi)標(biāo));MS譜用HP1100LC/MSD質(zhì)譜儀測(cè)定;元素分析用ElementarVarionELIII型元素分析儀測(cè)定。試劑均為市售化學(xué)純或分析純產(chǎn)品除特別說(shuō)明外,不經(jīng)處理直接使用。1以2h-5e5e,5a5e,5a5e,5e5e5e5e5e5e5e5e,5e5e5e5e5e5e5e,5-羥基苯甲酸5-溴丙烯酸5e,5-羥基苯甲酸5-溴丙烯酸5e,5-羥基苯甲酸5-溴丙烯酸5e,5-羥基苯甲酸5-溴丙烯酸5e,5-羥基苯甲酸5-溴丙烯酸5e,5-羥基苯甲酸5-溴丙烯酸5e,5-羥基苯甲酸5-溴丙烯酸鹽系苯甲醛3a5e5e,5-2-甲基苯丙酸5e,5-2-甲基苯甲酸5-2-甲基苯甲酸5-2-甲基苯丙酸5e,5-2-甲基苯丙酸5e,5-2-甲基苯丙酸5e,5-2-甲基苯丙酸5e,5-2-甲基苯甲酸5-2-甲基苯丙酸5e,5-2-甲基苯丙酸5e,5e,5a5e,5e,5e,5e,5e,5e,5e,5e,5e,5e,5e,5e,5e,5e,5e,5e,5e,5e,5e,5e,5e,5e,5e,5e,5e,5e,5e,5e,5e,5e,5e,5e,5e,5e-10-針對(duì)10e-10e-10-針對(duì)10e-10-氯苯丙酸方,10.2,10.7-10.2,10.2,10.7,10.7,10.7,10.7,10.7,10.7,10.7,10.7,10.7,10.7,10.7,10.7,10.7,10.7,10.7,10.7,10.7,10.7,10.7,10.7,10.7,10.7,10.74-羥基-3-甲氧基苯甲酸(2,香草酸)硝酸銀(17.0g,0.1mol)加入100mL蒸餾水,攪拌使溶解,緩慢加入氫氧化鈉溶液(4.4gNaOH溶于40mL蒸餾水),室溫?cái)嚢?0min,使氧化銀沉降,用蒸餾水以傾瀉法洗3次,將濕的氧化銀用20mL蒸餾水覆蓋,加2g氫氧化鈉,充分?jǐn)嚢?趁熱一次加入香草醛15.2g,繼續(xù)攪拌約20min,過(guò)濾,熱水洗,濾液通入SO25~10min,鹽酸酸化(pH約為2),冷卻后過(guò)濾,水洗,干燥,得香草酸11.5g。收率65.3%,mp208~210℃。4-羥基-3-甲氧基苯甲酸-3-溴丙酯(3a)2(4.33g,25.8mmol)溶于50mL丙酮中,加1,3-二溴丙烷(23.6g,100mmol)、三乙胺10mL,外溫50℃加熱反應(yīng)4h,冷卻至室溫,有大量白色固體析出,過(guò)濾,濾液濃縮,柱色譜分離得針狀固體4.53g。收率61.2%,mp102~104℃。4-羥基-3-甲氧基苯甲酸-4-溴丁酯(3b)方法同3a,由2與1,4-二溴丁烷制得,收率65.1%,mp76~78℃。4-羥基-3-甲氧基苯丙烯酸-2-溴乙酯(4a)方法同3a,由阿魏酸(ferulicacid)與1,2-二溴乙烷制得,收率67.3%,mp102~104℃。4-羥基-3-甲氧基苯丙烯酸-3-溴丙酯(4b)方法同3a,由阿魏酸與1,3-二溴丙烷制得,收率68.3%,mp100~102℃。4-羥基-3-甲氧基苯丙烯酸-4-溴丁酯(4c)方法同3a,由阿魏酸與1,4-二溴丁烷制得,收率70.1%,mp96~98℃。4-羥基-3-甲氧基苯丙烯酸-6-溴己酯(4d)方法同3a,由阿魏酸與1,6-二溴己烷制得,收率61.5%,mp90~92℃。4-羥基-3-甲氧基苯丙烯酸-4-溴-2-丁烯酯(4e)方法同3a,由阿魏酸與1,4-二溴-2-丁烯制得,收率69.1%,mp92~94℃。4-羥基苯丙烯酸-2-溴乙酯(5a)方法同3a,由對(duì)羥基桂皮酸(p-hydroxycinnamicacid)與1,2-二溴乙烷制得,收率68.5%,mp104~106℃。4-羥基苯丙烯酸-3-溴丙酯(5b)方法同3a,由對(duì)羥基桂皮酸與1,3-二溴丙烷制得,收率73.0%,mp98~100℃。4-羥基苯丙烯酸-4-溴丁酯(5c)方法同3a,由對(duì)羥基桂皮酸與1,4-二溴丁烷制得,收率71.2%,mp96~98℃。3-O-琥珀酸單?；?齊墩果酸(6)OA(2.50g,5.48mmol)、丁二酸酐(2.19g,21.9mmol)、DMAP(0.668g,5.48mmol)、無(wú)水CH2Cl2(60mL)依次加入反應(yīng)瓶中,加熱回流反應(yīng)48h。反應(yīng)液水洗3次,有機(jī)層無(wú)水Na2SO4干燥;過(guò)濾,濾液濃縮,柱色譜分離得產(chǎn)品1.70g,收率53.1%。3-O-{4-[2-甲氧基-4-(3-溴-丙氧羰基)-苯氧]-琥珀?；鶀-齊墩果酸(7a)6(556mg,1mmol)、3a(288mg,1mmol)、DCC(206mg,1mmol)及催化量的DMAP、無(wú)水CH2Cl210mL分別加入反應(yīng)瓶,室溫?cái)嚢璺磻?yīng),過(guò)濾,濾液減壓濃縮,柱色譜分離得產(chǎn)品500mg,收率60.6%。3-O-{4-[2-甲氧基-4-(4-溴-丁氧羰基)-苯氧]-琥珀?；鶀-齊墩果酸(7b)方法同7a,由6和3b反應(yīng)制得,收率58.3%。3-O-(4-{2-甲氧基-4-[2-(2-溴-乙氧羰基)-乙烯基]-苯氧}-琥珀?；?-齊墩果酸(8a)方法同7a,由6和4a反應(yīng)制得,收率72.4%。3-O-(4-{2-甲氧基-4-[2-(3-溴-丙氧羰基)-乙烯基]-苯氧}-琥珀酰基)-齊墩果酸(8b)方法同7a,由6和4b反應(yīng)制得,收率79.3%。3-O-(4-{2-甲氧基-4-[2-(4-溴-丁氧羰基)-乙烯基]-苯氧}-琥珀酰基)-齊墩果酸(8c)方法同7a,由6和4c反應(yīng)制得,收率68.0%。3-O-(4-{2-甲氧基-4-[2-(6-溴-己氧羰基)-乙烯基]-苯氧}-琥珀?；?-齊墩果酸(8d)方法同7a,由6和4d反應(yīng)制得,收率61.2%。3-O-[4-(2-甲氧基-4-{2-[4-溴-(2-丁烯氧羰基)]-乙烯基}-苯氧)-琥珀?；鵠-齊墩果酸(8e)方法同7a,由6和4e反應(yīng)制得,收率64.5%。3-O-{4-[2-(2-溴-乙氧羰基)-乙烯基]-苯氧}-琥珀?；?齊墩果酸(9a)方法同7a,由6和5a反應(yīng)制得,收率75.4%。3-O-{4-[2-(3-溴-丙氧羰基)-乙烯基]-苯氧}-琥珀?；?齊墩果酸(9b)方法同7a,由6和5b反應(yīng)制得,收率72.3%。3-O-{4-[2-(4-溴-丁氧羰基)-乙烯基]-苯氧}-琥珀?；?齊墩果酸(9c)方法同7a,由6和5c反應(yīng)制得,收率75.1%。3-O-{4-[2-甲氧基-4-(3-硝氧基-丙氧羰基)-苯氧]-琥珀?；鶀-齊墩果酸(10a)反應(yīng)瓶中依次加入7a(58.6mg,0.071mmol)、硝酸銀(18mg,0.11mmol)、乙腈(5mL),避光攪拌回流反應(yīng)過(guò)夜,有溴化銀黃色沉淀生成。反應(yīng)結(jié)束后,過(guò)濾,濾液濃縮,柱色譜分離得產(chǎn)品36.2mg,收率58.8%,mp98~100℃。3-O-{4-[2-甲氧基-4-(4-硝氧基-丁氧羰基)-苯氧]-琥珀?；鶀-齊墩果酸(10b)方法同10a,由7b制得,收率57.9%,mp110~112℃。3-O-(4-{2-甲氧基-4-[2-(2-硝氧基-乙氧羰基)-乙烯基]-苯氧}-琥珀?；?-齊墩果酸(11a)方法同10a由8a制得,收率60.1%,mp70~72℃。3-O-(4-{2-甲氧基-4-[2-(3-硝氧基-丙氧羰基)-乙烯基]-苯氧}-琥珀酰基)-齊墩果酸(11b)方法同10a由8b制得,收率56.3%,mp90~92℃。3-O-(4-{2-甲氧基-4-[2-(4-硝氧基-丁氧羰基)-乙烯基]-苯氧}-琥珀?；?-齊墩果酸(11c)方法同10a,由8c制得,收率69.5%,mp114~116℃。3-O-(4-{2-甲氧基-4-[2-(6-硝氧基-己氧羰基)-乙烯基]-苯氧}-琥珀?；?-齊墩果酸(11d)方法同10a由8d制得,收率59.2%,mp120~121℃。3-O-[4-(2-甲氧基-4-{2-[4-硝氧基-(2-丁烯氧羰基)]-乙烯基}-苯氧)-琥珀?；鵠-齊墩果酸(11e)方法同10a,由8e制得,收率51.4%,mp96~98℃。3-O-(4-{4-[2-(2-硝氧基-乙氧羰基)-乙烯基]-苯氧}-琥珀?；?-齊墩果酸(12a)方法同10a,由9a制得,收率75.0%,mp110~112℃。3-O-(4-{4-[2-(3-硝氧基-丙氧羰基)-乙烯基]-苯氧}-琥珀?；?-齊墩果酸(12b)方法同10a,由9b制得,收率68.1%,mp124~126℃。3-O-(4-{4-[2-(4-硝氧基-丁氧羰基)-乙烯基]-苯氧}-琥珀?；?-齊墩果酸(12c)方法同10a,由9c制得,收率57.5%,mp108~110℃。2藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)2.1gml-1及不同濃度