瑞格列奈片中有關(guān)物質(zhì)的測定

瑞格列奈片中有關(guān)物質(zhì)的測定

瑞格列奈是一種新型口服抗高血壓藥物，通過刺激胰島細(xì)胞分泌胰島素，不誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，副作用輕微，耐藥性好。它能安全有效地降低糖尿病患者的血糖，被稱為“食物葡萄糖抑制劑”?？蓡斡没蚺c其他降糖藥合用,如二甲雙胍、甘精胰島素等。具有廣闊的市場前景。通過對瑞格列奈及其中間體合成的研究發(fā)現(xiàn),瑞格列奈主要存在3種合成中間體,即有關(guān)物質(zhì)A(MPPBA,(1S)-3-methyl-1[2-(piperidin-1-yl)phenyl]butan-1-amine)、B(ECPAA,[3-ethoxy-4-(ethoxycarbonyl)phenyl]aceticacid)、C。有關(guān)物質(zhì)C是中間體,它直接水解即得到瑞格列奈終產(chǎn)物,且產(chǎn)率較高,純度經(jīng)HPLC法檢測可達(dá)到99%。本文參考中國藥典、美國藥典及進(jìn)口標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下瑞格列奈有關(guān)物質(zhì)項(xiàng),將有關(guān)物質(zhì)C不作為瑞格列奈有關(guān)物質(zhì)的考查項(xiàng),主要考查瑞格列奈有關(guān)物質(zhì)A、B,從而為瑞格列奈制劑有關(guān)物質(zhì)控制提供依據(jù)。1復(fù)合儀器和色譜Agilent1200色譜儀,包括G1313A自動進(jìn)樣器,HP1100紫外檢測器;色譜柱為DiamonsilC18柱(250mm×4.6mm,5μm);DECLA320酸度計(jì)(梅特勒-托利多儀器有限公司);A6-285電子天平(瑞士Mettler公司,精密度為百分之一);瑞格列奈對照品(USPROCKVILLE,純度99.9%,批號:GOD276);有關(guān)物質(zhì)A(USPROCKVILLE,批號:1600824);有關(guān)物質(zhì)B(USPROCKVILLE,批號:1600835);有關(guān)物質(zhì)C(USPROCKVILLE,批號:1600846);瑞格列奈片(自制,規(guī)格1mg/片,批號:120608、120705、120801);參比瑞格列奈片(德國諾和諾德公司,規(guī)格1mg/片,批號YM70448);甲醇為色譜純;試驗(yàn)用水為純化水,其他試劑均為分析純。2方法和結(jié)果2.1流動相ph值色譜柱:DiamonsilC18(250mm×4.6mm,5μm);流動相:磷酸二氫銨液(取磷酸二氫銨2.5g,加水1000mL使溶解,用磷酸調(diào)pH值至2.5)-甲醇(30:70)混合溶液;檢測波長:210nm;流速:1.0mL·min-1;進(jìn)樣量:20μL;柱溫:40℃。2.2溶液的制備2.2.1供試品溶液的制備取瑞格列奈片,研細(xì),取細(xì)粉適量(約相當(dāng)于瑞格列奈25mg),精密稱定,置25mL量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,精密量取8mL,置100mL量瓶中,加流動相稀釋至刻度,搖勻,即得供試品溶液。取淀粉、微晶纖維素(按主藥:輔料=1:5的比例,主藥含量為25mg)、其他輔料(按主藥:輔料=20:1的比例,主藥含量為25mg)適量,置25mL量瓶中,用流動相稀釋至刻度,搖勻,即得輔料溶液。2.2.2相關(guān)物質(zhì)的對照溶液2.2.3混合溶液配制精密量取瑞格列奈供試品和有關(guān)物質(zhì)A、B、C的甲醇儲備液各適量,同置50mL量瓶中,加流動相稀釋至刻度,混勻,配成濃度為瑞格列奈80μg·mL-1,有關(guān)物質(zhì)A、B、C均為1.5μg·mL-1的混合溶液。2.3色譜圖的測定在“2.1”項(xiàng)下的色譜條件,量取“2.2.3”項(xiàng)下的混合溶液、空白輔料20μL進(jìn)樣測定,記錄色譜圖。在“2.1”項(xiàng)色譜條件下,主峰瑞格列奈及有關(guān)物質(zhì)A、B和C的保留時(shí)間分別為14.6、4.8、3.3、12.8min分離度均>1.5,理論塔板數(shù)應(yīng)均>5000,對稱性良好(見圖1)。2.4進(jìn)樣及進(jìn)樣次數(shù)取“2.2.2”項(xiàng)下的有關(guān)物質(zhì)A、B的對照品溶液,按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件,進(jìn)樣20μL,連續(xù)進(jìn)樣6次。有關(guān)物質(zhì)A、B的峰面積值RSD分別為0.35%、0.87%,說明儀器精密度良好。2.5線性范圍與檢出限量取有關(guān)物質(zhì)A的甲醇儲備液適量,用流動相稀釋配成有關(guān)物質(zhì)A0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0μg·mL-1系列濃度溶液。分別精密量取20μL注入色譜儀,記錄色譜圖。同法,量取有關(guān)物質(zhì)B的甲醇儲備液適量,用流動相稀釋配成有關(guān)物質(zhì)B0.15、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0μg·mL-1系列濃度溶液,分別精密量取20μL注入高效液相色譜儀,記錄色譜圖。以進(jìn)樣濃度(C)為橫坐標(biāo),有關(guān)物質(zhì)峰面積(A)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,得有關(guān)物質(zhì)A回歸方程為A=9.7713C+0.0663,r2=0.9995;有關(guān)物質(zhì)B的回歸方程為A=44.24C+1.135,r2=0.9998。結(jié)果表明,有關(guān)物質(zhì)A與B在濃度范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系;有關(guān)物質(zhì)A濃度的線性范圍為0.5~3.0μg·mL-1;有關(guān)物質(zhì)B濃度的線性范圍為0.15~3.0μg·mL-1。2.6檢測限和定量限分別取有關(guān)物質(zhì)A、B線性范圍內(nèi)的最低濃度逐步稀釋,進(jìn)樣,取S/N為10的濃度為定量限濃度,S/N為3的濃度為檢測限濃度。測得有關(guān)物質(zhì)A檢測限為2ng,定量限為6ng;有關(guān)物質(zhì)B檢測限為0.3ng;定量限為0.6ng。2.7進(jìn)樣穩(wěn)定性測定取“2.2.2”項(xiàng)下的有關(guān)物質(zhì)A、B對照品溶液,濾過,取續(xù)濾液各20μL分別于0、0.5、1.0、2.0、4.0、12h時(shí)進(jìn)樣,記錄色譜圖,測得峰面積的RSD分別為0.9%和1.1%。結(jié)果表明有關(guān)物質(zhì)A、B在12h內(nèi)穩(wěn)定。2.8有關(guān)物質(zhì)a、b的配制稱取瑞格列奈片,研細(xì),取細(xì)粉適量(約相當(dāng)于瑞格列奈64.5mg),精密稱定,按“2.2.1”項(xiàng)下的供試品溶液配制方法,配成濃度為150μg·mL-1的溶液,精密量取適量分別置于3個(gè)10mL量瓶中,1個(gè)作為對照溶液,另外2個(gè)加入有關(guān)物質(zhì)A、B的儲備液分別為100、150、200μL用流動相稀釋至刻度,搖勻,配制成100μg·mL-1瑞格列奈溶液約含有關(guān)物質(zhì)A、B分別為1.0、1.5、2.0μg·mL-1的供試品溶液,取續(xù)濾液各20μL注入色譜儀,記錄色譜圖。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算回收率,結(jié)果見表1。2.9試驗(yàn)結(jié)果及有關(guān)物質(zhì)測定分別稱取各批自制樣品和參比制劑,研細(xì),精密稱定,取粉末適量,按“2.2.1”項(xiàng)下的方法用流動相配成供試品溶液及參比制劑的對照溶液;按“2.2.2”項(xiàng)下的方法用流動相配成1μg·mL-1的對照品溶液,按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件,精密量取20μL注入色譜儀,調(diào)節(jié)檢測靈敏度,使主成分峰高為記錄儀滿量程的10%~20%;再精密量取供試品溶液和對照品溶液各20μL,注入色譜儀,記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的2倍。供試品溶液如顯示有關(guān)物質(zhì)A、B的雜質(zhì)峰,單個(gè)雜質(zhì)的峰面積及其總和分別不得大于對照液主峰面積的0.25%和0.5%。3批樣品及參比瑞格列奈片的有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果見表2,試驗(yàn)表明在瑞格列奈片中有關(guān)物質(zhì)A、B及其他未知雜質(zhì)未超過限量;自制瑞格列奈片有關(guān)物質(zhì)與參比制劑有關(guān)物質(zhì)大致相符,符合藥典及申報(bào)要求。3討論3.1有關(guān)物質(zhì)的紫外-可見分光光度計(jì)檢測結(jié)果中國藥典2010年版二部中,瑞格列奈有關(guān)物質(zhì)項(xiàng)下檢測波長采用243nm,而美國藥典2009版中則采用240nm,進(jìn)口標(biāo)準(zhǔn)中則采用210nm。為確定合適的檢測波長,本試驗(yàn)采用日本島津UV-2501PC紫外-可見分光光度計(jì),用甲醇溶液配制濃度均為20μg·mL-1的有關(guān)物質(zhì)A對照品、有關(guān)物質(zhì)B對照品溶液及瑞格列奈對照品溶液。在190~340nm進(jìn)行紫外光譜掃描。試驗(yàn)結(jié)果表明,在210nm波長處,有關(guān)物質(zhì)A、B和瑞格列奈均具有較大吸收。因此,本試驗(yàn)選擇210nm為本試驗(yàn)的檢測波長。3.2溶液配制與稀釋通過對瑞格列奈的溶出度研究發(fā)現(xiàn)其溶解度低。在配制溶液時(shí),為減少溶劑對試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生的誤差,使樣品充分溶解,本試驗(yàn)在配制溶液時(shí),均先用少量甲醇使藥物充分溶解后,再精密量取各樣品甲醇儲備液適量,用流動相作為主要溶劑稀釋至刻度。3.3色譜條件的優(yōu)化參照各文獻(xiàn)資料的檢測方法,選用磷酸鹽緩沖液-乙腈(20:80)的流動相進(jìn)行梯度洗脫,結(jié)果發(fā)現(xiàn)雖然塔板數(shù)很高,但色譜峰嚴(yán)重拖尾,峰形不好,色譜峰不能得到很好的分離;選用醋酸銨緩沖液-甲醇(20:80)作為流動性相進(jìn)行洗脫,發(fā)現(xiàn)塔板數(shù)較低,色譜峰形前沿很嚴(yán)重。本試驗(yàn)選擇0.2%的磷酸二氫銨-甲醇(30:70)的流動相進(jìn)行洗脫驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)樣品的對稱因子為1,峰形較好,塔板數(shù)高,分離度均>1.5。并在不同的試驗(yàn)條件下對有關(guān)物質(zhì)的色譜行為進(jìn)行了考察,有關(guān)物質(zhì)A、B均能與主峰得到很好的分離,試驗(yàn)結(jié)果表明該方法操作準(zhǔn)確,