葡萄糖-6-磷酸酶G6P試劑盒說明書

第第頁葡萄糖-6-磷酸酶（G6P)試劑盒說明書葡萄糖6磷酸酶（G6P)試劑盒說明書微量法100管/96樣注意：測定前務(wù)必取23個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：葡萄糖6磷酸酶（(glucose6phosphatase，G6Pase，EC3.1.3.9）廣泛存在于動物、植物、微生物和細(xì)胞中，是糖異生過程水解葡萄糖6磷酸生成葡萄糖的限制酶，在保證血糖的動態(tài)平衡方面起著重要的作用。測定原理：G6P催化葡萄糖6磷酸生成葡萄糖，變旋酶和葡萄糖脫氫酶進(jìn)一步依次催化NAD+還原生成NADH，在340nm下測定NADH生成速率，即可反映G6P活性。需自備的儀器和用品：分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。試劑的組成和配制：提取液：100mL×1瓶，4℃保存；試劑一：液體19mL×1瓶，4℃保存；試劑二：粉劑×1支，20℃保存；試劑三：粉劑×1支，20℃保存；試劑四：試劑×1支，20℃保存；樣本的前處理：1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g4℃離心10min，取上清，置冰上待測。2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g4℃離心10min，取上清，置冰上待測。3、血清（漿）樣品：直接檢測。測定步驟：1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零。工作液的配制：臨用前將試劑二、試劑三和試劑四轉(zhuǎn)移到試劑一中混合溶解待用；用不完的試劑分裝后20℃保存，禁止反復(fù)凍融。2、將工作液置于37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)預(yù)熱5分鐘。3、在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本和190μL工作液，立即混勻，記錄340nm處初始吸光值A(chǔ)1和2min后的吸光值A(chǔ)2，計(jì)算ΔA=A2A1.注意：在該試劑盒中，若ΔA大于0.3，需將樣本用提取液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后測定，使ΔA小于0.3可提高檢測靈敏度。計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。G6P活性計(jì)算：a.用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下1、血清（漿）G6P活力計(jì)算單位定義：每毫升血清（漿）每分鐘生成1nmolNADH定義為一個酶活力單位。G6P（nmol/min/mL））＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷V樣÷T=1608×ΔA2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中G6P活力計(jì)算（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算單位定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1nmolNADH定義為一個酶活力單位。G6P（nmol/min/mgprot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr)÷T=1608×ΔA÷Cpr（2）按樣本鮮重計(jì)算單位定義：每g組織每分鐘生成1nmolNADH定義為一個酶活力單位。G6P（nmol/min/g鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W×V樣÷V樣總)÷T=1608×ΔA÷W（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：單位定義：每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成1nmolNADH定義為一個酶活力單位。G6P（nmol/min/104cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=3.215×ΔAV反總：反應(yīng)體系總體積，1×103L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.05mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，2min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬。b.用96孔板測定的計(jì)算公式如下1、血清（漿）G6P活力計(jì)算單位定義：每毫升血清（漿）每分鐘生成1nmolNADH定義為一個酶活力單位。G6P（nmol/min/mL））＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷V樣÷T=3216×ΔA2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中G6P活力計(jì)算（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算單位定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1nmolNADH定義為一個酶活力單位。G6P（nmol/min/mgprot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr)÷T=3216×ΔA÷Cpr（2）按樣本鮮重計(jì)算單位定義：每g組織每分鐘生成1nmolNADH定義為一個酶活力單位。G6P（nmol/min/g鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W×V樣÷V樣總)÷T=3216×ΔA÷W（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：單位定義：每1萬個細(xì)胞或細(xì)胞每分鐘生成1nmolNADH定義為一個酶活力單位。G6P（nmol/min/104cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=6.43×ΔAV反總：反應(yīng)體系總體積，2×104L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103L/mo