中華絨螯蟹胚胎附著系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)及形成機(jī)制

中華絨螯蟹胚胎附著系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)及形成機(jī)制

大多數(shù)淺棕色動(dòng)物的卵（胚胎）依賴于莖或卵石，囊被囊附并完全孵存出雌性腹部的囊毛（堵塞南山，1993；楊萬(wàn)喜等人，1996；dal，1965；cheung，1966；fisherandclark，1983；gooda和lachasi，1983；saigusa等人，2002）。卵子的成功附著對(duì)胚胎的正常發(fā)育具有重要的生物學(xué)意義。因此數(shù)十年來(lái)十足目甲殼動(dòng)物卵附著機(jī)制一直受到許多學(xué)者的重視。但迄今為止,關(guān)于胚胎附著系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)、卵柄或卵索的形成及胚胎附著機(jī)制尚存許多爭(zhēng)議(堵南山等,1995;楊萬(wàn)喜等,1996;應(yīng)雪萍等,2004a;薛俊增、吳惠仙,2004;AikenandWaddy,1982;Cheung,1966;FisherandClark,1983;GoudeauandLachaise,1980,1983;Goudeauetal.,1987;Hinsch,1990;Saigusa,1993;SaigusaandTerajima,2000;Saigusaetal.,2002;Stephens,1952;TalbotandHarper,1984;TalbotandGondeau,1988;Thomas,1991;Yonge,1937,1955)。中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis),隸屬于甲殼綱(Crustacea),十足目(Decapoda),是我國(guó)特有的淡水養(yǎng)殖種類。其胚胎發(fā)育在雌體腹肢形成的特殊孵化室中進(jìn)行。在育苗生產(chǎn)中,經(jīng)常出現(xiàn)胚胎未發(fā)育完成就從孵化室脫落的現(xiàn)象,這種現(xiàn)象稱為流產(chǎn)(Egg-loss)。有學(xué)者認(rèn)為胚胎附著系統(tǒng)的異常形成與胚胎的流產(chǎn)有直接的相關(guān)性(TalbotandZao,1991;TalbotandHarper,1984;楊萬(wàn)喜等,1996)。中華絨螯蟹的胚胎流產(chǎn)機(jī)理至今仍懸而未決。堵南山等(1995)曾報(bào)道了中華絨螯蟹成熟卵的形態(tài)和超微結(jié)構(gòu);楊萬(wàn)喜、周宏(2000)曾對(duì)中華絨螯蟹的腹肢粘液腺進(jìn)行了初步研究,發(fā)現(xiàn)粘液腺與胚胎附著系統(tǒng)的形成有關(guān);應(yīng)雪萍等(2004a)進(jìn)一步對(duì)不同生理階段的雌蟹腹肢進(jìn)行組織學(xué)與掃描電鏡的研究,證實(shí)了楊萬(wàn)喜和周宏(2000)的觀點(diǎn)。此外,應(yīng)雪萍等(2004b,2004c)對(duì)不同生理階段的中華絨螯蟹肝胰腺、不同發(fā)育時(shí)期胚胎的脂肪酸、氨基酸進(jìn)行分析研究,認(rèn)為中華絨螯蟹肝胰腺、不同發(fā)育時(shí)期胚胎中必需脂肪酸及必需氨基酸的種類及含量與胚胎的發(fā)育與流產(chǎn)有一定的關(guān)系。為進(jìn)一步弄清中華絨螯蟹胚胎流產(chǎn)機(jī)理,闡明粘液腺與胚胎附著系統(tǒng)間的關(guān)系,作者用透射電鏡和掃描電鏡技術(shù)對(duì)中華絨螯蟹胚胎附著系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)組成及形成機(jī)制等進(jìn)行了觀察。1產(chǎn)卵蟹的收集實(shí)驗(yàn)所用的中華絨螯蟹取自溫州市樂(lè)清清江養(yǎng)殖場(chǎng)。分別于2002年12月至2003年3月、2003年12月至2004年3月先后兩次在清江養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行抱卵和孵化實(shí)驗(yàn)。并購(gòu)得溫州本地成熟親蟹10只及已交配的親蟹100只,帶回實(shí)驗(yàn)室,置于裝有新鮮海水(緩慢升溫并恒溫至18℃)的5只玻璃缸中(55cm×50cm×40cm),飼喂新鮮的縊蟶(Sinonovaculaconstricta)。本研究的重要步驟是收集那些剛開始產(chǎn)卵的雌蟹,但雌蟹產(chǎn)卵沒有可視的信號(hào);在不驚動(dòng)雌蟹的情況下,在養(yǎng)殖場(chǎng)不能很準(zhǔn)確地區(qū)分即將產(chǎn)卵蟹與剛開始產(chǎn)卵的蟹。我們的方法是,將部分交配后的雌蟹帶回實(shí)驗(yàn)室,放在玻璃水族箱中,晝夜連續(xù)觀察雌蟹的行為變化,這樣便于確立即將產(chǎn)卵的蟹,增加了獲得即將或者剛剛開始產(chǎn)卵的雌蟹的機(jī)率。一旦發(fā)現(xiàn)即將或者剛產(chǎn)卵的雌蟹,就跟蹤該蟹。本實(shí)驗(yàn)共跟蹤觀察了19只親蟹的產(chǎn)卵過(guò)程,并進(jìn)行取材。透射電鏡用的成熟卵直接從成熟蟹的卵巢中取得,從雌蟹腹部取得剛排出的受精卵、受精卵產(chǎn)出后5min、10min、15min、20min、30min、40min、1h、1.5h、2h、3h、2周后及1個(gè)月后的胚胎,這些卵與胚胎用0.1mol/L磷酸緩沖液(pH7.4)配制的2.5%戊二醛(v/v)及1%鋨酸(m/m)進(jìn)行雙固定,酒精系列脫水,618環(huán)氧樹脂滲透并包埋,瑞典LKB2088超薄切片機(jī)切片,醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色,JEOLJEM-1200EX透射電鏡觀察并拍照。取成熟蟹卵巢中的卵、剛從生殖孔中排出的受精卵及排出后不同時(shí)間的胚胎、抱卵蟹腹肢,用0.1mol/L磷酸緩沖液(pH7.4)配制的2.5%戊二醛及1%餓酸進(jìn)行雙固定,酒精系列脫水,醋酸異戊酯置換,CO2臨界點(diǎn)干燥,離子濺射儀噴金,HitachiS-450及KyKy-1000B掃描電鏡觀察并拍照。2結(jié)果2.1抱卵材料的膜中華絨螯蟹雌蟹具四對(duì)腹肢,每一對(duì)腹肢分別由內(nèi)肢(攜卵肢)和外肢(非攜卵肢)組成,內(nèi)肢由攜卵剛毛(Ovigoroussetae)及其上的攜卵絨毛(Ovigoroushair)組成(圖版Ⅰ:1,2)。受精卵(胚胎)通過(guò)卵柄(Eggstalk)附著在攜卵絨毛上(圖版Ⅰ:3),部分胚胎通過(guò)卵索(Eggfuniculus)彼此相連(圖版Ⅰ:4)。透射電鏡觀察表明:與中華絨螯蟹胚胎附著系統(tǒng)相關(guān)的膜有卵膜、卵柄與被膜。卵柄是由成熟胚胎最外層的卵膜延伸而成(圖版Ⅰ:5),形成后的卵柄通過(guò)包在攜卵絨毛外的被膜附著在攜卵絨毛上(圖版Ⅰ:6,7)。2.1.1電子密度特征圖版Ⅰ:8顯示了受精卵進(jìn)入孵化室一個(gè)月后的成熟胚胎卵膜的細(xì)微結(jié)構(gòu),卵膜由三層組成:外層的E1、中層E2和內(nèi)層E3。E1層電子密度較低,又可分為兩亞層,稱之為E1a和E1b組成(圖版Ⅰ:7)。E2層電子密度高,而且較厚(圖版Ⅰ:8;圖版Ⅱ:9)。最內(nèi)層E3相對(duì)較薄,而且形成時(shí)間較長(zhǎng)(圖版Ⅰ:8)。圖版Ⅱ:9顯示了E3層正在形成的過(guò)程,不同部位厚薄不一。2.1.2卵柄和卵柄的亞層組成圖版Ⅰ:5顯示卵柄與胚胎交接處的結(jié)構(gòu)。卵柄只有一層組成,且這一層與包裹在胚胎最外層的E1是連續(xù)的,此外,卵柄也由兩個(gè)亞層E1a和E1b組成(圖版Ⅱ:10)。卵柄的基部包裹在攜卵絨毛上,以產(chǎn)生分層的被膜,被膜的厚度在攜卵絨毛的不同側(cè)面而不同,厚的部位約為薄的部位的6倍多(圖版Ⅰ:6)。2.1.3攜帶卵絨的層間和遠(yuǎn)緣受壓ls觀察附有卵團(tuán)的腹肢,發(fā)現(xiàn)被膜是由卵柄纏繞在攜卵絨毛上形成的。有些纏繞是不完全的,但在大部分情況下,卵柄在剛毛上至少繞了一周(圖版Ⅰ:6,7)。被膜的每一部分像卵柄一樣,只有E1層(圖版Ⅰ:6,7;圖版Ⅱ:10)。因此,包裹在攜卵絨毛上的被膜、卵柄均來(lái)源于卵膜的最外層,屬于同源結(jié)構(gòu)。當(dāng)用鑷子撥落成團(tuán)的胚胎時(shí),大多數(shù)絨毛從剛毛上脫離,而被膜仍然緊緊地包在攜卵絨毛上。當(dāng)觀察胚胎附著系統(tǒng)的橫切面時(shí),可見到E1a直接粘到攜卵絨毛上(圖版Ⅰ:6,7;圖版Ⅱ:10,11)。橫切面顯示了在攜卵絨毛的表面有一層約50nm厚的薄層(α1),此層通過(guò)其上以間隔150nm左右的、且有許多纖細(xì)的電子密度稍深的、平行排列的嵴與E1a相接觸。在α1層的內(nèi)部有一層電子密度相對(duì)較低、約320nm厚的薄層(α2)(圖版Ⅱ:11)。2.2產(chǎn)后胚胎配件系統(tǒng)的形成2.2.1--5卵柄及卵期71-20d本文根據(jù)在養(yǎng)殖場(chǎng)及實(shí)驗(yàn)室中跟蹤了19只蟹的產(chǎn)卵行為,結(jié)合顯微照片給出大概的卵柄形成時(shí)間順序,描述如下。附著準(zhǔn)備期:中華絨螯蟹的受精卵從生殖孔產(chǎn)出,然后進(jìn)入孵化室。在正常情況下,將所有的卵產(chǎn)出大概要15到25min。產(chǎn)卵后,雌蟹靜立,腹部半開。與此同時(shí),腹肢的攜卵絨毛將卵揉成團(tuán)。卵剛產(chǎn)出時(shí)無(wú)粘性。產(chǎn)卵15min后,孵化室內(nèi)的粘液量增加。這種出現(xiàn)在孵化室內(nèi)的透明液體稱為孵化液,受精卵浸泡在此液體中。此時(shí)卵膜已具有粘性,部分卵已開始粘附在攜卵絨毛上。從未見到受精卵粘到外肢的羽狀剛毛上。卵柄形成期:產(chǎn)卵后20到50min,雌蟹仍靜立不動(dòng),腹部依舊半開,受精卵繼續(xù)被攜卵絨毛揉成團(tuán),但粘到攜卵絨毛上的卵的數(shù)目顯著增加了。當(dāng)卵粘著到攜卵絨毛上時(shí),卵膜開始膨脹。此時(shí),卵膜仍有很強(qiáng)的粘性,被膜開始形成,卵柄初具形態(tài)(圖版Ⅱ:12)。胚胎附著期:產(chǎn)卵60min后,卵膜的粘性實(shí)際上已經(jīng)降低,浸沒卵群的孵化液量減少。產(chǎn)卵后80-140min之間,卵柄形成基本完成,大部分胚胎通過(guò)卵柄牢固地附著在攜卵絨毛上(圖版Ⅱ:13)。隨著“卵柄”的形成,雌蟹的腹部開始上下移動(dòng),使所有的受精卵都被包在孵化室中。一般產(chǎn)卵2h后,雌蟹腹部停止運(yùn)動(dòng)。2.2.2成蟲、卵胞外亞層和生殖孔最外層E1的起源和產(chǎn)卵后的形態(tài)變化圖版Ⅱ:14,15顯示了卵巢中成熟卵的結(jié)構(gòu),卵被卵泡細(xì)胞包裹,在其內(nèi)側(cè)為由兩個(gè)亞層(稱之為E1a′和E1b′)組成的卵黃膜,E1b′的厚度約為E1a′的3倍。卵細(xì)胞膜與卵黃膜間為卵周隙,圖版Ⅱ:15中可見卵內(nèi)物質(zhì)通過(guò)細(xì)胞膜的突起往此空隙中輸送。受精卵從生殖孔排出后,卵細(xì)胞膜外僅見由兩個(gè)亞層組成的膜(E1),E1的兩個(gè)亞層的厚度均比在卵巢中成熟卵的厚1倍多(圖版Ⅱ:16)。受精卵從生殖孔中排出5min(圖版Ⅱ:17)到10min(圖版Ⅱ:18;圖版Ⅲ:19)后,E1與胚胎間的空隙增大,同時(shí)胚胎向腔中的分泌活動(dòng)加強(qiáng)。排卵后20min,E1與胚胎間的分泌物明顯增加,并出現(xiàn)大量的膜狀結(jié)構(gòu)(圖版Ⅲ:20)。隨后腔中出現(xiàn)電子密度均勻的顆粒狀結(jié)構(gòu)(圖版Ⅲ:21),并且范圍逐漸擴(kuò)大,密度也不斷增加,里面為一層很薄的E2層(圖版Ⅲ:22)。卵排出40-60min后,E1的兩個(gè)亞層E1a′、E1b′結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,邊界模糊(圖版Ⅲ:23),這一狀態(tài)保持了約20-35min。在產(chǎn)卵后60-90min,E1又分為電子密度明顯不同的兩個(gè)亞層,稱之為E1a和E1b(圖版Ⅲ:24)。但是這兩個(gè)新亞層是否與起初的E1a′和E1b′有關(guān),目前尚不清楚。2.2.3卵膜內(nèi)固定期e除了外層E1,尚有中層E2及內(nèi)層E3包裹著胚胎。E2層既不在卵柄的結(jié)構(gòu)中,也不在被膜的結(jié)構(gòu)中。E2形成于E1兩個(gè)亞層在結(jié)構(gòu)上發(fā)生變化的時(shí)候(圖版Ⅲ:23),大概在產(chǎn)卵后40-60min。在E1兩個(gè)新亞層(E1a和E1b)出現(xiàn)時(shí),E2開始加厚(圖版Ⅲ:24)。當(dāng)卵膜粘附在攜卵絨毛上后立即開始膨脹。卵膜粘附在攜卵絨毛上的時(shí)間大約是產(chǎn)卵后15-50min。此時(shí)卵膜具有很強(qiáng)的粘性,胚胎與胚胎的卵膜往往也粘在一起(圖版Ⅰ:4)。產(chǎn)卵40min后,E1的兩個(gè)亞層E1a′、E1b′的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,主要表現(xiàn)在兩者的電子致密度趨向一致。當(dāng)E1新的兩個(gè)亞層出現(xiàn)時(shí),部分區(qū)域的E1層與E2層發(fā)生分離,這意味著E1開始膨脹或延伸,卵柄開始形成(圖版Ⅲ:24)。如圖版Ⅲ:25顯示E1層附著在攜卵絨毛的下半層,卵柄已經(jīng)形成,并可牢固地附著在攜卵絨毛上(圖版Ⅱ:13)。E2層形成后,胚胎繼續(xù)向外分泌物質(zhì),為E2層的加厚及E3層的形成做好物質(zhì)準(zhǔn)備(圖版Ⅲ:23,24)。E3層的形成可能需要一個(gè)很長(zhǎng)的過(guò)程,圖版Ⅲ:26顯示的是排卵2周后的胚胎,E3層已初步形成。3討論3.1膜的形成與亞層的結(jié)構(gòu)中華絨螯蟹胚胎附著系統(tǒng)由卵膜、卵柄及包裹在攜卵絨毛上的被膜三部分組成。這與紅螯相手蟹(Sesarmahaematocheir)胚胎附著系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)相似(Saigusa,1994;Saigusaetal.,2002)。我們還發(fā)現(xiàn)剛產(chǎn)入雌蟹孵化室中的受精卵擁有由兩個(gè)亞層組成的E1層,在排卵后E1的兩個(gè)亞層電子致密度趨向一致,但隨后又重新形成兩個(gè)亞層。卵柄和包在攜卵絨毛外的被膜僅由卵膜的最外層E1組成,這與Saigusaetal.(2002)、Goudeauetal.(1983)分別對(duì)紅螯相手蟹和濱蟹(Carcinusmaenas)的研究結(jié)果一致。但兩個(gè)亞層發(fā)生融合的時(shí)間及被膜、卵柄的形成,不同種類有一定的區(qū)別。紅螯相手蟹在排卵后5-10min,其兩個(gè)亞層就發(fā)生融合,然后被膜和卵柄相繼形成;中華絨螯蟹胚胎附著系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)形成相對(duì)較慢,這可能與動(dòng)物個(gè)體的大小相關(guān)。中華絨螯蟹成熟胚胎的卵膜由E1、E2、E3三層組成,這與其它許多甲殼動(dòng)物的卵膜結(jié)構(gòu)一致,但E2層、E3層形成的時(shí)間不同種類差異較大(Cheung,1966;Goudeauandlachaise,1983;Goudeauetal.,1987)。堵南山等(1995)曾對(duì)中華絨螯蟹成熟卵形態(tài)的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察,他們認(rèn)為成熟蟹卵由三層卵膜組成,根據(jù)該文圖文描述的特點(diǎn),這三層膜其實(shí)就是本文中成熟卵卵膜的E1a′(又可分為電子密度不同的兩個(gè)小亞層)和E1b′(圖Ⅱ:14,15)。Cheung(1966)用光學(xué)顯微鏡觀察了濱蟹(Carcinusmaenas)成熟胚胎的卵膜,其所描述的三層結(jié)構(gòu)與我們所報(bào)道的中華絨螯蟹的三層卵膜有所差異。GoudeauandLachaise(1980)也對(duì)濱蟹的卵膜形成過(guò)程進(jìn)行了透射電鏡的研究,其描述的最外層E1和最厚層E2與中華絨螯蟹的E1、E2層較為相似,但沒有看到E3層的結(jié)構(gòu)。后來(lái)Goudeauetal.(1987)進(jìn)一步對(duì)濱蟹胚胎發(fā)育整個(gè)過(guò)程的卵膜進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)了卵膜的三層結(jié)構(gòu)。此外,Saigusaetal.(2002)對(duì)紅螯相手蟹成熟胚胎的胚胎附著系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和形成過(guò)程的描述與本研究的結(jié)果較相似。這可能是不同動(dòng)物種類的胚胎,其三層膜的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)及比例均有一定差異;或是由于不同學(xué)者所取的胚胎成熟度不一所致。3.2卵膜膨脹、組織、腹或多卵一材料等時(shí)放置時(shí)的胚胎附著方式中華絨螯蟹產(chǎn)卵后E1a′、E1b′層的膨脹或許在皮層反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生,這層的膨脹是首次有價(jià)值的形態(tài)變化(GoudeauandLachaise,1980;TalbotandGoudeau,1988)。在產(chǎn)卵后40min,E1a′和E1b′的電子致密度趨向一致。產(chǎn)卵后60min,新的亞層E1a和E1b形成。中華絨螯蟹與其它甲殼動(dòng)物一樣,剛產(chǎn)出卵的卵膜也是單一的,之后,隨著E1a′和E1b′的電子致密度趨向一致及新E1層的形成,卵膜膨脹并變得有粘性,通過(guò)雌蟹腹部不斷運(yùn)動(dòng),腹肢揉動(dòng)胚胎,這種行為將增大卵膜與攜卵絨毛間的接觸面積,卵膜延伸,并產(chǎn)生卵柄(楊萬(wàn)喜等,1996;GoudeauandLachaise,1980;Goudeauetal.,1987;Cheung,1966;TalbotandGoudeau,1988;Saigusaetal.,2002)。因此,十足類甲殼動(dòng)物的胚胎附著可能由相同的方式進(jìn)行。一些十足目甲殼動(dòng)物,如海喇蛄屬(Homarus)(Yonge,1937;TalbotandHarper,1984)、小長(zhǎng)臂蝦屬(Palaemonetes)(Burkenroad,1947)和長(zhǎng)臂蝦屬(Palaemon)(FisherandClark,1983)動(dòng)物的胚胎,不僅通過(guò)卵柄附著在攜卵絨毛上,而且部分胚胎也通過(guò)卵索相互附著在一起。薛俊增和吳惠仙(2004)在三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)的胚胎附著中也發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象,并稱之為多卵一剛毛式附著。中華絨螯蟹胚胎間也有相互附著的現(xiàn)象,但很少。在中華絨螯蟹的卵膜粘性很強(qiáng)時(shí),將不僅會(huì)附著在攜卵絨毛上,而且胚胎間也會(huì)