廣東省登革熱2型病毒全序列測(cè)定及遺傳進(jìn)化分析

廣東省登革熱2型病毒全序列測(cè)定及遺傳進(jìn)化分析

病毒登格熱（dv）屬于黃病毒科，為單帶和正鏈鈉病毒。自然界存在的DV有4種血清型(DEN1~4),每種血清型都可引起登革熱(denguefever,DF)、登革出血熱(denguehemorrhagicfever,DHF)和登革休克綜合征(dengueshocksyndrome,DSS)。從發(fā)病率和死亡率看,DV感染引起的疾病是重要的蟲(chóng)媒病毒病之一,在除歐洲以外的所有大陸都有流行。系統(tǒng)發(fā)育(phyogeny)指生物種族的進(jìn)化歷史。系統(tǒng)發(fā)育研究可揭示時(shí)間和地點(diǎn)相距較遠(yuǎn)的病毒分離株之間的基因關(guān)系,從而發(fā)現(xiàn)某一流行事件是過(guò)去流行株復(fù)發(fā)還是從外界傳入。從分子進(jìn)化角度對(duì)不同地域的DV基因特定區(qū)段及全序列進(jìn)行變異研究,對(duì)弄清全球DV傳播演化歷史、控制DV的流行具有重要意義。我們測(cè)定了3株從廣東省不同時(shí)間流行的登革熱臨床標(biāo)本中分離的DEN2病毒的全序列,并探討我國(guó)分離株的基因型及其致病性與基因型之間的關(guān)系。1材料和方法1.1酶、dna連接酶、rna酶和三現(xiàn)有酶的關(guān)系PMD19-T載體、凝膠回收試劑盒、TaqDNA聚合酶、DNA連接酶、RNA酶購(gòu)自大連寶生物科技有限公司,Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen公司,一步法RT-PCR試劑盒購(gòu)自Promega公司。1.2血清中分離的細(xì)胞3株DEN2病毒為廣州軍區(qū)疾病預(yù)防控制中心(CDC)在登革熱流行期間于急性期患者血清中分離,編號(hào)為GD09/93、GD05/98和GD19/2001,它們分別于1993年分離自廣東省佛山市、1998年分離自廣東省南海市和2001年分離自廣東省江門(mén)市;均對(duì)乳鼠致病,對(duì)C6/36和Vero細(xì)胞敏感。JM109宿主菌由廣州市CDC保存。1.3引物設(shè)計(jì)及合成參考DEN2牙買(mǎi)加(1409/88,GenBank登錄號(hào):M20558)株基因組序列,用PremierPrimer5.0軟件分別設(shè)計(jì)合成12對(duì)引物,引物長(zhǎng)度為17~22nt,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為400~1300bp,引物序列見(jiàn)圖1和表1。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。1.4病毒培養(yǎng)和流產(chǎn)DV接種C6/36細(xì)胞培養(yǎng)增殖,取上清加入Trizol試劑,加入氯仿后離心,取水相加異丙醇沉淀,制備總RNA。1.5循環(huán)循環(huán)的選擇用一步法RT-PCR試劑盒進(jìn)行RT-PCR,反應(yīng)條件:50℃30min;94℃2min;94℃30s,55℃30s,72℃3min,35個(gè)循環(huán);72℃7min。用Tris-硼酸(TBE)緩沖液配制含0.5mg/L溴化乙錠質(zhì)量濃度為0.015kg/L的瓊脂糖凝膠,取5μlPCR產(chǎn)物,與1μl上樣緩沖液混和,在TBE緩沖液中以80V恒壓電泳30min,在透射紫外分析儀上觀察,以出現(xiàn)相應(yīng)的特異性條帶為陽(yáng)性結(jié)果,用DNA凝膠回收試劑盒切膠回收。1.6含氨芐激素的lb平板制備擴(kuò)增片段經(jīng)凝膠回收試劑盒回收后,與PMD19-T載體連接,轉(zhuǎn)化JM109宿主菌,涂布含氨芐青霉素、IPTG和X-gal的LB平板,37℃培養(yǎng)過(guò)夜,挑取白色菌落接種含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基,煮沸裂解。取1μl用PCR進(jìn)行初步鑒定。1.7根據(jù)pgrt-pcr產(chǎn)物序列測(cè)定經(jīng)鑒定后的各片段重組質(zhì)粒由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。1.8全基因組dna法序列測(cè)定后的各片段序列采用Seqman程序(DNAstarsoftwarepackage)進(jìn)行拼接并組裝成完整的全基因組序列,經(jīng)過(guò)核對(duì)校正后上傳至GenBank。1.9氨基酸同源比較利用DNAstar軟件包中的Megalign程序3株病毒和海南DEN2-04株(GenBank登錄號(hào):AF119661)的堿基及氨基酸序列進(jìn)行同源比較;利用DNAstar軟件包中的Protein程序?qū)Φ鞍椎目乖院褪杷灶A(yù)測(cè);應(yīng)用DANMANversion6軟件,將3株DEN2序列同其他作為參考的DEN2病毒全基因序列(表2)共25株進(jìn)行序列多重比對(duì)(multiplealignment),之后根據(jù)各序列間的遺傳距離(kimura)構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)(phylogenetictree)。2結(jié)果2.1分子質(zhì)量檢測(cè)所有PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳和紫外燈觀察,發(fā)現(xiàn)各產(chǎn)物分子質(zhì)量為400~1300bp不等,各片段分子質(zhì)量均與預(yù)期相符,回收片段克隆到PMD19-T載體。各重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定后,各篩選1個(gè)插入片段和預(yù)期一致的克隆提取質(zhì)粒供測(cè)序使用。2.2氨基酸序列序列分析GD09/93、GD05/98和GD19/2001株基因組全序列均登錄在GenBank中。3株DEN2病毒的全基因組長(zhǎng)度均為10723nt,5′及3′端各有一非編碼區(qū);結(jié)構(gòu)基因和非結(jié)構(gòu)基因位于基因組97~10269nt之間,共編碼3391個(gè)氨基酸,讀碼結(jié)構(gòu)完全相同。GD05/98和GD09/93、GD05/98和GD19/2001、GD09/93和GD19/2001之間的堿基序列同源性分別為93.3%、92.4%和97.6%,氨基酸序列同源性分別為96.7%、96.5%和98.5%。將對(duì)乳鼠不具神經(jīng)毒力的參考株DEN2-04與GD09/93、GD05/98、GD19/2001株非編碼區(qū)、結(jié)構(gòu)蛋白、非結(jié)構(gòu)蛋白堿基的序列分段比較(表3),發(fā)現(xiàn)堿基差異分散在各個(gè)功能區(qū),未發(fā)現(xiàn)顯著的高變區(qū)或長(zhǎng)段的保守區(qū)。在氨基酸序列方面,除GD09/93和GD19/2001之間的NS2B區(qū)沒(méi)有差異外,其他區(qū)域均有氨基酸序列差異存在,與堿基的差異率變化基本保持一致。用DNAstar的Megalign程序?qū)EN2-04、GD09/93、GD19/2001和GD05/98株的氨基酸序列比較后,發(fā)現(xiàn)4株間共有187個(gè)氨基酸差異。除GD09/93、GD05/98、GD19/2001之間不同外,仍有44個(gè)差異氨基酸位點(diǎn)。26個(gè)氨基酸的變化為同類(lèi)氨基酸之間的變化,這些變化不影響氨基酸所帶電荷或極性。非極性與不帶電荷的極性氨基酸之間的變化有12個(gè)位點(diǎn);非極性氨基酸與帶電荷的極性氨基酸之間的變化有1個(gè)位點(diǎn);不帶電荷的極性氨基酸與帶電荷的氨基酸之間的變化有4個(gè)位點(diǎn);帶相反電荷的氨基酸之間的變化有1個(gè)位點(diǎn)。共有18個(gè)位點(diǎn)引起電荷或極性的變化(表4),這些位點(diǎn)經(jīng)Protein程序?qū)乖院褪杷灶A(yù)測(cè),結(jié)果只有PrM-134、NS2A-153、NS4B-102所帶電荷的變化對(duì)抗原性影響較大(圖2)。2.33de2c基因型劃分國(guó)外研究者多以堿基的差異在6%以上作為基因型的分型標(biāo)準(zhǔn),其基本原則是能區(qū)分不同地理區(qū)域的分離株。Thant等根據(jù)E/NSl結(jié)合區(qū)序列將52株不同地理株DEN2分成5個(gè)基因型(Ⅰ~Ⅴ)。按同樣的差異劃分,本研究中的序列可分成4個(gè)基因型,分別對(duì)應(yīng)Thant等的Ⅰ~Ⅳ基因型。GD05/98株與泰國(guó)分離株同為Ⅱ基因型,GD09/93、GD19/2001株與印度尼西亞、澳大利亞和臺(tái)灣株分在Ⅳ基因型(圖3)。3dv毒力位點(diǎn)及安全性分析DV感染是世界上最流行的蟲(chóng)媒病毒性疾病之一,致病機(jī)制尚不清楚。DV的進(jìn)化遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn),其基因多樣性正在增加,導(dǎo)致產(chǎn)生大量不同毒力的病毒株,這意味著人類(lèi)將受到更多樣的致病性DV攻擊?；蚪M全序列的測(cè)定在一定程度上,對(duì)病毒基因變異有監(jiān)測(cè)作用,尤其在廣東省登革熱流行區(qū)需要大規(guī)模且長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)研究,才能闡明DV的基因變異及進(jìn)化規(guī)律。本研究中3株DEN2病毒生物學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)均具有乳鼠神經(jīng)毒力,因此將GD09/93、GD05/98、GD19/2001株與對(duì)乳鼠不具神經(jīng)毒力的DEN2-04株進(jìn)行基因組全序列分析,共有18個(gè)位點(diǎn)引起電荷或極性的變化。毒株全基因組除C和NS2B蛋白相對(duì)保守,未出現(xiàn)變化,其余均有不同的位點(diǎn)變化。與國(guó)內(nèi)外學(xué)者報(bào)道過(guò)的毒力相關(guān)位點(diǎn)PrM-15、PrM-28、PrM-31、PrM-164、NS1-164、E-62、E-69、E-71、E-112、E-124、E-126、E-311、E-203、E-390、NS1-117、NS1-129、NS1-272和NS4B-52等比較[8,9,10,11,12,13,14,15,16,17],除E-62外,其余均不相符,其中包括多次報(bào)道毒力增強(qiáng)的位點(diǎn)E-126(Glu→Lys)和E-390(Asp→Asn)也未出現(xiàn)在本研究的3株病毒中。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,DV毒力位點(diǎn)表現(xiàn)出不同的流行株不一定完全相同。進(jìn)一步對(duì)18個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,經(jīng)Protein程序?qū)乖院褪杷灶A(yù)測(cè),結(jié)果只有PrM-134、NS2A-153、NS4B-102所帶電荷的變化對(duì)抗原性影響較大,單個(gè)氨基酸的變化往往就能影響這些蛋白的功能,從而影響毒力,這些位點(diǎn)的變化是否導(dǎo)致病毒毒力的變異有待研究。對(duì)來(lái)自不同地區(qū)的25株DEN2病毒(表3)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)