脛骨內(nèi)接種mrm-1細(xì)胞制作乳腺癌骨轉(zhuǎn)移大鼠模型的研究

脛骨內(nèi)接種mrm-1細(xì)胞制作乳腺癌骨轉(zhuǎn)移大鼠模型的研究

乳腺癌的骨轉(zhuǎn)移可能導(dǎo)致高血鈣、疼痛和病理性骨折，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，并引起臨床和基礎(chǔ)研究人員的注意。在基礎(chǔ)研究中建立接近自然發(fā)病過(guò)程的動(dòng)物模型十分重要,目前乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的造模方法大致有四類,包括自發(fā)性、化學(xué)誘導(dǎo)性、轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)性和移植性乳腺癌骨轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型,其中以移植性模型應(yīng)用最為普遍。目前國(guó)內(nèi)的移植性骨轉(zhuǎn)移模型多采用裸鼠,但裸鼠體積較小,造模時(shí)操作困難,且存在價(jià)格較貴、飼養(yǎng)條件要求較高、取材少等不足。譚煌英博士在國(guó)內(nèi)最先成功引進(jìn)了乳腺癌骨轉(zhuǎn)移大鼠模型。大鼠模型在形體、取材量、費(fèi)用等方面存在明顯優(yōu)勢(shì)。本研究小組對(duì)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移進(jìn)程中的多個(gè)重要環(huán)節(jié)進(jìn)行了研究,探討了這一模型的特點(diǎn),介紹如下:1材料表面1.1動(dòng)物雌性SD大鼠,SPF級(jí),體重150～160g,合格證號(hào)SCXK(京)2007-0001,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。1.2細(xì)胞MRMT-1轉(zhuǎn)移性大鼠乳腺癌細(xì)胞株由日本東北大學(xué)加齡醫(yī)學(xué)研究所醫(yī)用細(xì)胞資源中心引進(jìn)。1.3抗體和pcr引物抗酒石酸酸性磷酸酶染色試劑盒由美國(guó)SigmaAldrich公司生產(chǎn);抗PCNA抗體由美國(guó)CellSignalingTechnology公司生產(chǎn);抗OPG抗體和抗RANKL抗體由美國(guó)SantaCruzBiotechnology公司生產(chǎn)。dNTP、AMV反轉(zhuǎn)錄酶、重組RNA酶抑制劑和隨機(jī)引物均由美國(guó)Promega公司生產(chǎn);PCR引物由上海英駿(Invitrogen)生物技術(shù)有限公司合成;SYBRPremixExTaq由寶生物(大連)工程有限公司生產(chǎn)。1.4醫(yī)用x光診斷系統(tǒng)21G/22G注射器針頭由美國(guó)BectonDickinson(BD)公司生產(chǎn)。VonFrey纖維由美國(guó)NorthCoastMedical公司生產(chǎn);大鼠失能測(cè)量?jī)x由意大利2Biological公司生產(chǎn)。KXO-32R醫(yī)用X光診斷系統(tǒng)由日本Toshiba公司生產(chǎn);Prodigy雙能X線骨密度儀由美國(guó)GeneralElectric(GE)公司生產(chǎn)。IX71型倒置顯微鏡和DP70數(shù)碼成像系統(tǒng)由日本Olympus公司生產(chǎn)。SIGMA3-18K低溫離心機(jī)由德國(guó)Sartorius公司生產(chǎn);ND-1000紫外分光光度計(jì)由美國(guó)Nanodrop公司生產(chǎn);AlphaImager2200凝膠成像系統(tǒng)由美國(guó)AlphaInnotech公司生產(chǎn);PTC基因擴(kuò)增儀由美國(guó)MJRearch公司生產(chǎn);ABI7300熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀由美國(guó)AppliedBiosystems公司生產(chǎn)。2方法2.1傳代培養(yǎng)造模前1周對(duì)液氮中凍存的MRMT-1細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇和傳代培養(yǎng)。造模當(dāng)天對(duì)培養(yǎng)瓶中貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化,收集細(xì)胞懸液,洗滌計(jì)數(shù)后配制成濃度為1×106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液,造模前置于冰上備用。2.2細(xì)胞輸注模型組雌性SD大鼠分2批飼養(yǎng),每批適應(yīng)1周后按照體重分層,隨機(jī)分為假手術(shù)組和模型組,每組共16只。造模步驟:將大鼠腹部向上置于鼠板上,左后肢皮毛用生理鹽水濕潤(rùn)后剪毛,然后使用75%醫(yī)用酒精消毒。取手術(shù)刀片切開(kāi)脛骨上部的皮膚和肌肉,切口長(zhǎng)度約1cm,暴露左脛骨內(nèi)側(cè)面。在膝關(guān)節(jié)以下約5mm處的脛骨內(nèi)側(cè)面,先用21G或22G針頭穿刺打孔,針頭穿透骨皮質(zhì)進(jìn)入骨髓腔后,使用微量注射器吸取生理鹽水(假手術(shù)組)或配制好的癌細(xì)胞懸液3μl(模型組,細(xì)胞數(shù)約為3×103),緩慢注射入大鼠骨髓腔內(nèi)。撤出微量注射器后迅速用骨蠟(在50～52℃水浴中保溫)密封針孔以防癌細(xì)胞懸液從骨髓腔溢出?？p合肌肉和皮膚。造模當(dāng)天記為第0天。2.3體重測(cè)量在造模前1天用電子天平稱量體重,實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每周稱重1次并記錄。2.4機(jī)械痛覺(jué)超敏試驗(yàn)在造模后第19天進(jìn)行疼痛測(cè)定。通過(guò)50%縮足閾值(50%PWT)顯示機(jī)械痛覺(jué)超敏,通過(guò)大鼠失能測(cè)量?jī)x測(cè)定的雙側(cè)后肢負(fù)重差異表示機(jī)械痛覺(jué)過(guò)敏。熱縮足反射潛伏期(TWL)用于評(píng)價(jià)熱痛覺(jué)過(guò)敏。2.4.1左下肢眼底中心部位pwt的計(jì)算將大鼠置于金屬網(wǎng)上,使用有機(jī)玻璃罩限制其活動(dòng),待梳理探究活動(dòng)基本消失后,用標(biāo)準(zhǔn)化的VonFrey纖維刺激左后肢足底中心部位,采用up-down法計(jì)算50%PWT。2.4.2雙術(shù)后負(fù)重量對(duì)比將大鼠放置在大鼠失能測(cè)量?jī)x特制的有機(jī)玻璃小室內(nèi),前肢趴在斜面上,雙后肢分別踩著2個(gè)相互獨(dú)立的傳感器,讓動(dòng)物適應(yīng)1～2分鐘后開(kāi)始測(cè)量,測(cè)量時(shí)間為5秒,完畢后儀器即可顯示出雙后肢負(fù)重值。每只動(dòng)物連續(xù)測(cè)3次,取算術(shù)平均值,對(duì)比雙側(cè)后肢負(fù)重量并計(jì)算差值:兩側(cè)后肢負(fù)重差值=右側(cè)負(fù)重量-左側(cè)負(fù)重量2.4.3TWL在熱痛刺激儀的燈座上架放厚度為3mm的玻片,將大鼠置于玻片上,調(diào)整射燈使其聚焦在大鼠左后肢足底,記錄從照射開(kāi)始至大鼠出現(xiàn)縮足的時(shí)間,如果照射10秒大鼠仍未縮足則自動(dòng)斷開(kāi)以免灼傷。每只大鼠測(cè)3次,間隔2分鐘以上,最后取算術(shù)平均值。2.5術(shù)后大鼠腫瘤長(zhǎng)度和短徑觀察造模后第21天進(jìn)行取材,取材前已禁食10小時(shí)。使用0.45%戊巴比妥鈉溶液按照1ml/100g體重腹腔注射,將大鼠麻醉。稱量體重后處死大鼠,剪下左后肢。對(duì)于第1批飼養(yǎng)的大鼠,將剪下的左后肢直接置于4%多聚甲醛中進(jìn)行固定,待X線檢查后剝離皮膚和肌肉,用游標(biāo)卡尺測(cè)定腫瘤長(zhǎng)徑和短徑。按下列公式計(jì)算腫瘤體積:腫瘤體積=(腫瘤長(zhǎng)徑×腫瘤短徑2)/2對(duì)于第2批飼養(yǎng)的大鼠,剪下左后肢后立即將皮膚和肌肉組織剝離,暴露出帶有轉(zhuǎn)移腫瘤的脛骨,迅速測(cè)量腫瘤長(zhǎng)、短徑,使用經(jīng)過(guò)RNA酶處理的手術(shù)剪剪下小塊骨轉(zhuǎn)移瘤組織置于液氮中凍存。2.6骨皮質(zhì)結(jié)構(gòu)正常對(duì)多聚甲醛固定后的大鼠后肢進(jìn)行X線攝片(電壓50kV,曝光時(shí)間2ms),對(duì)骨質(zhì)破壞程度評(píng)分,標(biāo)準(zhǔn)如下:0分:骨結(jié)構(gòu)正常,無(wú)任何骨質(zhì)破壞的征象。1分:脛骨注射部位附近可見(jiàn)小型骨質(zhì)缺損病灶(數(shù)量少于3個(gè))。2分:髓質(zhì)骨缺損,病灶增多(數(shù)量大于3個(gè))。3分:髓質(zhì)骨缺失,同時(shí)皮質(zhì)骨受侵。4分:單面的骨皮質(zhì)完全缺損。5分:雙面的骨皮質(zhì)缺失,移位性骨折。注:左側(cè)為假手術(shù)組,骨皮質(zhì)完整;右側(cè)為模型組,本例骨皮質(zhì)侵蝕嚴(yán)重2.7軟骨和骨轉(zhuǎn)移腫瘤在X線檢查后將固定的大鼠后肢剝?nèi)テつw和肌肉組織,保留完整的脛骨和骨轉(zhuǎn)移腫瘤。將待測(cè)標(biāo)本置于一個(gè)盛滿水的塑料盒中,放在Prodigy雙能X線骨密度儀的平臺(tái)上掃描,計(jì)算骨礦物質(zhì)含量(BMC)和骨密度(BMD)。2.8脫鈣液的更換大鼠脛骨在4%多聚甲醛中固定約10天,然后轉(zhuǎn)入脫鈣液(10%甲醛+EDTA超飽和溶液)脫鈣8周,每1～2周更換脫鈣液1次。脫鈣完成后進(jìn)行石蠟包埋切片,完成的標(biāo)本厚度約4μm。2.8.1he染色2.8.2trap細(xì)胞計(jì)數(shù)按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行TRAP染色,在IX71顯微鏡下觀察,每張切片在高倍鏡下(×400)隨機(jī)選取5個(gè)視野,用DP70數(shù)碼成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集,然后對(duì)這些視野中的TRAP(+)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),取算術(shù)平均值。2.8.3觀察形態(tài)觀察按照說(shuō)明書(shū)對(duì)PCNA、OPG和RANKL進(jìn)行免疫組化染色。在IX71學(xué)顯微鏡下觀察形態(tài),每張切片在高倍鏡下(×200)隨機(jī)選取3個(gè)視野進(jìn)行拍攝;使用Image-ProPlus(IPP)軟件測(cè)定所拍攝的圖像中被染成黃褐色部分的整體光密度(IOD)值,取算術(shù)平均值。2.9rp的mr-na含量從第2批大鼠含腫瘤的脛骨組織中提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄cDNA,用熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法測(cè)定甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白(PTHrP)的mRNA含量,并以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)的mR-NA含量作為內(nèi)參照。引物序列如下(表1):在ABI7300熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀中進(jìn)行反應(yīng),記錄Ct值,通過(guò)比較Ct值方法對(duì)兩組樣品所含的PTHrPmRNA進(jìn)行相對(duì)定量,公式如下:目的基因的相對(duì)量=2-ΔΔCt其中ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)實(shí)驗(yàn)組-(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)對(duì)照組。2.10術(shù)后負(fù)重量比較數(shù)據(jù)錄入Excel軟件進(jìn)行保存,使用SPSS15.0軟件分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,采用方差分析進(jìn)行組間比較。同一組內(nèi)的大鼠兩側(cè)后肢負(fù)重量比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。50%PWT和影像學(xué)評(píng)分為等級(jí)資料;TRAP細(xì)胞計(jì)數(shù)為頻數(shù)資料,以上3組數(shù)據(jù)用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行分析。3結(jié)果3.1體重測(cè)兩組大鼠造模前體重?zé)o差異,顯示基線水平一致,在飼養(yǎng)過(guò)程中兩組大鼠體重均逐漸增長(zhǎng),但組間比較仍無(wú)差異。3.2疼痛測(cè)試3.2.1機(jī)械痛覺(jué)超敏狀態(tài)模型組50%PWT較假手術(shù)組明顯降低(P<0.01),這提示存在機(jī)械痛覺(jué)超敏狀態(tài)。假手術(shù)組雙側(cè)后肢負(fù)重則較為平衡,模型組出現(xiàn)雙側(cè)下肢負(fù)重不平衡的情況(P<0.01);模型組雙側(cè)后肢負(fù)重差值明顯高于假手術(shù)組(P<0.01),提示存在機(jī)械痛覺(jué)過(guò)敏。3.2.2熱痛的代價(jià)模型組大鼠左足受到熱輻射后的TWL較假手術(shù)組明顯縮短(P<0.01),提示存在熱痛覺(jué)過(guò)敏的狀態(tài)。3.3腫瘤體積假手術(shù)組無(wú)腫瘤生長(zhǎng),因此模型組與之比較差異明顯(P<0.01)。3.4注射部位皮質(zhì)缺損通過(guò)X線檢查發(fā)現(xiàn),假手術(shù)組大鼠僅有1只在左脛骨注射部位出現(xiàn)輕度骨質(zhì)缺損,考慮為手術(shù)本身造成的損傷未完全愈合,其余大鼠均呈現(xiàn)正常的骨結(jié)構(gòu),無(wú)骨質(zhì)破壞征象,模型組骨質(zhì)受損嚴(yán)重(P<0.01)。3.5bmc和bmc兩組間BMC無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,模型組BMD較假手術(shù)組降低(P<0.05)。3.6骨小梁排列網(wǎng)HE染色可以顯示出兩組大鼠脛骨組織的形態(tài)變化。在低倍鏡(×40)下可見(jiàn):假手術(shù)組大鼠脛骨結(jié)構(gòu)完整,骨皮質(zhì)連續(xù),骨小梁排列規(guī)則,骨髓腔內(nèi)充滿深染的血細(xì)胞。模型組骨髓腔內(nèi)外均可見(jiàn)大量腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn),形態(tài)不規(guī)則,排列紊亂。部分骨皮質(zhì)被腫瘤組織所取代,連續(xù)性中斷,呈現(xiàn)火山口樣結(jié)構(gòu),甚至形成腫瘤組織包圍的孤島狀。骨皮質(zhì)與周邊不成熟的編織骨和軟骨相移行,新生骨組織間隙內(nèi)可見(jiàn)腫瘤細(xì)胞,編織骨表面整齊排列一層成骨細(xì)胞。3.7模型組和假手術(shù)組trap+細(xì)胞的表達(dá)情況破骨細(xì)胞在TRAP染色下胞漿紅染,即TRAP(+)。假手術(shù)組僅在骨基質(zhì)邊緣見(jiàn)到少量TRAP(+)細(xì)胞,通常是單個(gè)出現(xiàn)。模型組在被侵蝕的骨基質(zhì)邊緣和瘤體中均可見(jiàn)到成群甚至大群分布的TRAP(+)細(xì)胞,大小不一,其中可見(jiàn)多個(gè)巨型多核細(xì)胞,體積明顯大于假手術(shù)組。通過(guò)計(jì)數(shù),模型組TRAP(+)細(xì)胞均明顯多于假手術(shù)組(P<0.01)。說(shuō)明模型組出現(xiàn)了破骨細(xì)胞過(guò)度激活的情況,這是溶骨性骨質(zhì)破壞的核心環(huán)節(jié)。3.8組pcna和rakenl的比較光鏡下免疫組化染色(+)部分呈現(xiàn)黃褐色,使用IPP軟件測(cè)量IOD值進(jìn)行半定量分析,模型組PCNA和RANKL有升高趨勢(shì),但無(wú)統(tǒng)計(jì)差異。模型組較假手術(shù)組的OPC水平和OPG/RANKL比值下降(P<0.05或P<0.01)。說(shuō)明在本模型中腫瘤細(xì)胞并沒(méi)明顯增加RANKL的表達(dá),但會(huì)抑制OPG的表達(dá),從而降低OPG/RANKL比值,造成破骨細(xì)胞的過(guò)度激活。3.9ptrtp的高表達(dá)通過(guò)比較Ct值的相對(duì)定量方法對(duì)兩組樣品所含的目的基因PTHrP的mRNA進(jìn)行相對(duì)定量,模型組低于假手術(shù)組(P<0.01),這一結(jié)果說(shuō)明此模型不具有PTHrP高表達(dá)的特征。4乳腺癌骨轉(zhuǎn)移中pthp的表達(dá)本研究使用的乳腺癌骨轉(zhuǎn)移大鼠模型是將MRMT-1大鼠乳腺癌細(xì)胞接種至SD大鼠脛骨骨髓腔內(nèi)建成,隨著腫瘤生長(zhǎng),骨質(zhì)逐漸受損,同時(shí)伴有癌性骨痛表現(xiàn)。模刨組大鼠在術(shù)后第19天已出現(xiàn)機(jī)械痛覺(jué)超敏、機(jī)械痛覺(jué)過(guò)敏和熱痛覺(jué)過(guò)敏,第21天取材后脛骨X線影像顯示明顯的骨質(zhì)破壞、BMD下降,形態(tài)學(xué)觀察可見(jiàn)腫瘤在骨髓腔內(nèi)和脛骨周邊呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng),侵蝕破壞骨皮質(zhì),同時(shí)伴有不成熟的編織骨和軟骨形成。證實(shí)大鼠乳腺癌骨轉(zhuǎn)移/癌性骨痛模型已成功建立。有研究顯示,乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者中以溶骨性病變?yōu)橹饕憩F(xiàn)者占80%～85%。因此,本模型表現(xiàn)出的溶骨性改變是乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的重要特征,其核心環(huán)節(jié)是骨微環(huán)境中各種因素引起的破骨細(xì)胞過(guò)度激活,導(dǎo)致骨吸收作用失控。破骨細(xì)胞起源于單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng),通常由多個(gè)單核細(xì)胞融合并激活才能具有活性,1個(gè)活化的破骨細(xì)胞可以溶解100個(gè)成骨細(xì)胞所形成的骨質(zhì)。本項(xiàng)研究通過(guò)對(duì)破骨細(xì)胞的特征性酶TRAP進(jìn)行染色比較兩組大鼠破骨細(xì)胞的數(shù)量和活躍程度,模型組破骨細(xì)胞數(shù)量和活性均明顯超過(guò)假手術(shù)組(P<0.01),這說(shuō)明存在破骨細(xì)胞的過(guò)度激活,這與影像檢查發(fā)現(xiàn)的骨質(zhì)破壞一致,說(shuō)明破骨細(xì)胞的過(guò)度激活所導(dǎo)致的骨吸收作用亢進(jìn)是造成溶骨性病變的直接原因。OPG-RANKL-RANK系統(tǒng)是破骨細(xì)胞活化過(guò)程中的一個(gè)重要信號(hào)傳導(dǎo)通路,此三者均為腫瘤壞死因子家族成員,RANKL是一種激動(dòng)因子,可通過(guò)與破骨前體細(xì)胞表面的NF-KB受體激活因子(receptoractivatorofNF-KB,RANK)結(jié)合使之激活從而刺激破骨細(xì)胞分化成熟;OPG是RANKL的圈套受體,與RANK競(jìng)爭(zhēng)RANKL,從而抑制破骨細(xì)胞的分化和成熟。RANKL和OPG的水平反映了骨吸收的程度,RANKL過(guò)多將增加骨吸收;OPG過(guò)多則抑制骨吸收,正常情況下二者處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。發(fā)生腫瘤骨轉(zhuǎn)移時(shí)腫瘤細(xì)胞釋放的多種因子破壞了這種平衡,導(dǎo)致破骨細(xì)胞過(guò)度激活進(jìn)而促進(jìn)了骨吸收作用。同時(shí),骨吸收時(shí)從骨基質(zhì)中釋放的TGF-β3等因子又會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖,從而形成“惡性循環(huán)”。有研究認(rèn)為乳腺癌細(xì)胞可以分泌PTHrP,刺激成骨細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)RANKL,從而增強(qiáng)破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收作用。本項(xiàng)研究中,PTHrP水平不但未升高反而出現(xiàn)下降,其機(jī)制有待更加深入的研究。動(dòng)物模型是探索乳腺癌骨轉(zhuǎn)移病理機(jī)制