姜黃素對急性脊髓損傷大鼠運動功能的影響

姜黃素對急性脊髓損傷大鼠運動功能的影響

氧氣反應(yīng)應(yīng)激活急性髓質(zhì)傷理過程中的重要作用。因此，抗旱性損害是急性髓質(zhì)傷理治療的熱點。在機體中,核因子E2相關(guān)因子2(nuclearfactorerythroid2-relatedfactor2,Nrf2)/抗氧化反應(yīng)原件(antioxidantrespondelement,ARE)信號通路是非常重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路,它可以編碼及調(diào)節(jié)多種抗氧化基因的表達,增強細(xì)胞對氧化應(yīng)激的抵抗性,從而減少氧化應(yīng)激對機體造成的損害。姜黃素來源于植物姜黃的干燥根莖,具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、清除自由基、抗纖維化等一系列藥理作用。最近有研究報道姜黃素能夠改善急性脊髓損傷大鼠的預(yù)后,但其機制卻不甚明確。本實驗采用改良的Allen’s打擊法建立大鼠急性脊髓損傷模型,觀察姜黃素對建模大鼠氧化應(yīng)激損傷的保護作用以及對Nrf2/ARE/γ-GCS信號通路的影響,旨在探討姜黃素對大鼠急性脊髓損傷的保護作用及其機制。材料和方法1實驗試劑與模型的建立1.1SD雌性大鼠60只(重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供),體重200~250g;姜黃素與二甲基亞砜(DMSO)(Sigma公司),Nrf2抗體(Bioworld公司),γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)抗體(Santacruze公司),β-肌動蛋白(β-action)抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司),鏈霉菌抗生素蛋白-過氧化物連接(SP)免疫組化試劑盒、辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗、DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司),丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所),聚丙烯酰胺凝膠(SDS)配制試劑盒、電化學(xué)(ECL)發(fā)光試劑盒、二喹啉甲酸法(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)。1.2急性脊髓損傷模型的建立采用改良的Allen’s打擊法,10%水合氯醛(0.35ml/100g)麻醉大鼠,將大鼠俯臥,固定于鼠板上,摘除T9~T10椎板,暴露脊髓,用自制改良的Allen’s打擊器以50g/cm(重量為10g的擊打棍從5cm高空自由落體)的致傷能量造成脊髓急性損傷,撞擊成功標(biāo)志為:撞擊脊髓組織水腫、出血,硬脊膜完整,但呈紫紅色,大鼠尾巴出現(xiàn)痙攣性擺動,雙下肢軀體回縮樣撲動,呈遲緩性痙攣。模型制作成功后需每日2次擠壓膀胱排尿,直至形成膀胱反射。1.3實驗分組SD雌性大鼠60只,隨機平均分為假手術(shù)組、模型組、姜黃素低劑量組(40mg/kg,CUR-L組)、姜黃素高劑量組(100mg/kg,CUR-H組),各組均為15只。將姜黃素溶于0.1%DMSO的磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液中,其中姜黃素高、低劑量組在脊髓損傷前1d給予相應(yīng)劑量的姜黃素腹腔注射,每日1次,持續(xù)7d。假手術(shù)組和模型組腹腔注射等體積含0.1%DMSO的PBS溶液。2檢測方法2.1運動功能方面采用脊髓損傷后后肢運動功能評分系統(tǒng)(BBB)評分法評價大鼠后肢運動功能,觀察其后肢的關(guān)節(jié)活動、步態(tài)等運動功能。評分共分為3個部分:第1部分評價動物后肢各關(guān)節(jié)活動(0~7分);第2部分評價動物后肢步態(tài)及協(xié)調(diào)功能(8~13分);第3部分評價動物后肢運動中爪的精細(xì)動作(14~21分),3個部分滿分共21分。評分者為非本實驗組人員且熟知BBB評分標(biāo)準(zhǔn),每只動物均評定3次。2.2mda含量測定于設(shè)定實驗時間點麻醉處死大鼠,取損傷段脊髓組織,用4℃生理鹽水按1:9(W/V)制成10%的脊髓勻漿,將勻漿液以3000r/min離心15min后取上清液,參照試劑盒說明嚴(yán)格操作測定MDA含量。2.3蛋白凝膠的制備取脊髓組織80~100mg勻漿,RIPA裂解并用BCA法測定蛋白濃度,每組取相等蛋白量進行SDS電泳,將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上,室溫下5%脫脂奶粉封閉2h,Nrf2、γ-GCS一抗稀釋比例1:1000,4℃孵育過夜;二抗稀釋比例為1:1000,37℃孵育1h,ECL發(fā)光顯色;感光膠片壓片,內(nèi)參采用β-actin。以Nrf2/β-actin和γ-GCS/β-actin的灰密度比值作為目標(biāo)蛋白相對表達量。2.4固定方法固定于設(shè)定實驗時間點麻醉處死大鼠,經(jīng)左心室灌注肝素化生理鹽水,直至灌注液清亮后再以4%多聚甲醛灌注行在體脊髓組織固定。隨后分離脊髓組織固定于4%多聚甲醛24h,常規(guī)石蠟包埋,冠狀切面切片,蘇木精-伊紅(HE)染色,樹脂封片后鏡下觀察脊髓組織病理變化。2.5胞漿用焦色表達檢測采用北京中杉金橋公司SP法免疫組化試劑盒進行染色操作,嚴(yán)格按照其說明步驟進行。Nrf2一抗稀釋比例1:100,以胞漿棕褐色為陽性表達;γ-GCS一抗稀釋比例1:50,以胞漿棕褐色為陽性表達。實驗結(jié)果由兩位專業(yè)免疫組化實驗人員進行獨立評定,采用inmagepro-plus6.0對目標(biāo)蛋白進行分析,以平均吸光度值為標(biāo)準(zhǔn)對各組目標(biāo)蛋白進行評定。3軟件分析數(shù)據(jù)采用xˉ±sxˉ±s表示,SPSS11.5軟件進行分析。組間比較采用單因素方差分析,組間進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗,P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果1兩組假手術(shù)組的比較假手術(shù)組評分基本正常;模型組評分顯著低于假手術(shù)組(P<0.05);CUR-L組及CUR-H組評分明顯高于模型組(P<0.05),但仍低于假手術(shù)組,見表1。2各組大鼠髓組織mda含量比較模型組大鼠脊髓組織MDA含量較假手術(shù)組明顯升高(P<0.05);CUR-L組及CUR-H組大鼠脊髓組織MDA含量較模型組明顯下降(P<0.05),但仍未達到假手術(shù)組水平,見表1。與假手術(shù)組相比:*P<0.05;與模型組相比:#P<0.053各組nrf2蛋白表達水平比較結(jié)果顯示,模型組Nrf2、γ-GCS蛋白表達水平明顯高于假手術(shù)組(P<0.05);與假手術(shù)組比較,CUR-L組及CUR-H組Nrf2蛋白表達水平逐漸增強(P<0.05);CUR-L組γ-GCS蛋白水平高于模型組(P<0.05),CUR-H組γ-GCS蛋白水平明顯高于模型組(P<0.05),見圖1,表2。與假手術(shù)組相比:*P<0.05;模型組相比:#P<0.054神經(jīng)元的缺如假手術(shù)組大鼠脊髓灰白質(zhì)交界清楚,無出血及水腫灶,神經(jīng)元豐富,核仁清晰,無核固縮及壞死現(xiàn)象;模型組可見散在的出血灶,間質(zhì)水腫并有空腔形成,大量炎性細(xì)胞浸潤,膠質(zhì)細(xì)胞增生,正常的細(xì)胞形態(tài)嚴(yán)重破壞,細(xì)胞變性壞死嚴(yán)重,神經(jīng)元大量丟失甚至缺如;CUR-L和CUR-H組與模型組相比,炎性細(xì)胞明顯減少,膠質(zhì)細(xì)胞增生不明顯,細(xì)胞排列較為整齊和規(guī)則,變性壞死的細(xì)胞明顯減少,僅能夠觀察到少許細(xì)胞的核固縮現(xiàn)象,有較多的神經(jīng)元存活;其中,CUR-H組較CUR-L組改變更為明顯,見圖2。5各組nrf2、-gcs蛋白表達水平比較免疫組化檢測結(jié)果顯示,模型組Nrf2、γ-GCS蛋白表達水平均明顯高于假手術(shù)組(P<0.05),與模型組比較,CUR-L組、CUR-H組Nrf2、γ-GCS蛋白表達水平逐漸增強,CUR-H組增高更為顯著(P<0.05),見圖3、4,表3。與假手術(shù)組相比:*P<0.05;與模型組相比:#P<0.05nrf2/關(guān)于-gcs信號通路研究表明,脊髓損傷造成的最終神經(jīng)功能障礙主要由兩種機制引起的,即原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷,原發(fā)性損傷多為由外力造成的機械性損傷,且產(chǎn)生的神經(jīng)損害是不可逆的。繼發(fā)性損傷發(fā)生于原發(fā)損傷后的數(shù)分鐘到數(shù)天內(nèi),現(xiàn)多認(rèn)為由原發(fā)性損傷造成的髓鞘和軸突的破壞、局部組織缺血、水腫、血管痙攣、微循環(huán)障礙而引發(fā)的一系列細(xì)胞內(nèi)代謝和基因改變,包括局部血管的改建和缺血、炎性遞質(zhì)的聚集、與脂質(zhì)過氧化反應(yīng)有關(guān)的自由基損傷、興奮性遞質(zhì)與電解質(zhì)失衡等。這些變化相互促進相互影響,會加重脊髓的損傷程度,甚至?xí)鹪l(fā)性損傷后幸存下來的神經(jīng)細(xì)胞繼發(fā)性凋亡或壞死。其中,氧化應(yīng)激反應(yīng)中產(chǎn)生的大量活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)與自由基在繼發(fā)性損傷的發(fā)生、發(fā)展上起著關(guān)鍵的作用。在評價機體氧化應(yīng)激的程度時,MDA是最常用的指標(biāo)之一,機體內(nèi)過多的氧自由基能攻擊生物膜上的多不飽和脂肪酸,引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用,并形成脂質(zhì)過氧化物,如MDA,因此測試MDA的含量能夠反映機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度,間接地反映組織細(xì)胞受到氧化應(yīng)激損傷的程度。本實驗中,大鼠模型組脊髓組織MDA含量顯著高于假手術(shù)組,說明損傷后大鼠的脊髓組織中存在著氧化應(yīng)激損傷。當(dāng)脊髓組織遭受氧化應(yīng)激損傷時,細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)對于降低氧化應(yīng)激引起的神經(jīng)元損傷至關(guān)重要,其中Nrf2/ARE信號通路是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最為重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路,Nrf2是亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄激活因子家庭(CNC)家族成員,共有一高度保守的堿性亮氨酸拉鏈(leucimezipperbZIP)結(jié)構(gòu)。生理狀態(tài)下主要在細(xì)胞質(zhì)中與Keap1(Kelch-likeECH2associatedprotein1)蛋白結(jié)合,不具有轉(zhuǎn)錄活性。當(dāng)受到內(nèi)源性或外源性ROS等親電子物質(zhì)的攻擊時,Nrf2與Keap1解離并轉(zhuǎn)位進入細(xì)胞核與與Maf蛋白結(jié)合成異二聚體后與ARE序列結(jié)合,進而啟動下游受ARE調(diào)控的抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄,提高機體抗氧化應(yīng)激的能力。到目前為止,已發(fā)現(xiàn)Nrf2/ARE信號通路調(diào)控的可編碼內(nèi)源性基因超過200個,其中,作為Nrf2/ARE信號路徑的主要調(diào)節(jié)蛋白,抗氧化酶類不僅能夠催化自由基轉(zhuǎn)化為無毒物質(zhì),還能加強其水溶性利于其排除,是機體維持氧化還原平衡的重要因素。γ-GCS就是機體內(nèi)非常重要的受此通路編碼調(diào)節(jié)的一類抗氧化蛋白酶,γ-GCS是體內(nèi)還原型谷胱甘肽(GSH)合成的限速酶,是一個由重鏈亞單位(γ-GCSh)和輕鏈亞單位(γ-GCSl)組成的二聚體。重鏈具有全酶的催化功能,輕鏈無催化活性,但對重鏈的活性起調(diào)節(jié)作用,機體內(nèi)γ-GCS的含量和活性的升高,可以增強組織細(xì)胞抗氧化的能力。實驗中我們發(fā)現(xiàn)模型組Nrf2和γ-GCS蛋白表達水平明顯高于假手術(shù)組,說明急性脊髓損傷后的氧化應(yīng)激損傷能夠?qū)е翹rf2/ARE信號通路的激活,繼而上調(diào)γ-GCS的表達,共同參與到機體的抗氧化損傷防御。近年來姜黃素具有抗氧化作用已經(jīng)受到人們的廣泛關(guān)注,研究表明:姜黃素不僅能夠激活多種抗氧化蛋白的表達,而且自身作為一種供氫體也是一種強有效的自由基清除劑,從而直接和間接地發(fā)揮其抗氧化作用。其對神經(jīng)元的保護作用也在多項實驗中得到證實,但它的這些作用是否與上調(diào)Nrf2/ARE通路有關(guān)卻鮮有報道。本實驗中,我們觀察到CUR-L組和CUR-H組能夠明顯地上調(diào)Nrf2蛋白的表達,進而促進抗氧化蛋白酶γ-GCS的表達增強,而組織中MDA含量卻明顯降低,證明了姜黃素加強了脊髓損傷大鼠的抗氧化損傷能力。而且,通過對大鼠后肢功能評分和脊髓組織病理學(xué)檢查我們也可以發(fā)現(xiàn),姜黃素能夠明顯改善脊髓損傷后大鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)情況,減輕脊髓組織的損傷程度。這提示在脊髓損傷早期就運用姜黃素進行抗氧化治療對疾病的預(yù)后是具有非常積極的影響的。姜黃素來源于姜科植物姜黃,而姜黃在中國和印度的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中已被廣泛運用,療效肯定。而姜黃素作為姜黃的主要藥理成分,其多種藥理作用及安全性