登革病毒包膜e蛋白區(qū)denved3的結(jié)構(gòu)與功能

登革病毒包膜e蛋白區(qū)denved3的結(jié)構(gòu)與功能

病毒登格病毒（denv）是黃病毒屬的一種單體正鏈rna病毒，以昆蟲為手段，廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)。感染可引起普遍發(fā)熱、登格熱、嚴重的登格血熱和登格斯坦?。╠hf）、登格斯坦?。╯ds）和登格斯坦病（dhf）等疾病，嚴重危及人類健康。成熟的登革病毒顆粒直徑約50nm,內(nèi)部含感染性的單股RNA分子,長約11kb,含單一的可讀框,首先翻譯出一個含約3500個氨基酸殘基的聚蛋白前體(NH2-C-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-COOH),而后被位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中的宿主信號肽酶和病毒蛋白酶切割成3個結(jié)構(gòu)蛋白(C、prM/M和E)和7個非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)。其中,包膜糖蛋白E為病毒包膜的重要組成部分,根據(jù)包膜E蛋白的抗原性不同,登革病毒可分為4個血清型(DENV1、DENV2、DENV3和DENV4),感染其中的任何一型均可產(chǎn)生對此種血清型病毒的終身免疫,但不同型之間的交叉保護性免疫較為短暫。其中,病毒感染產(chǎn)生的非中和抗體還可介導抗體依賴的感染增強現(xiàn)象(antibodydependentenhancement,ADE),即當初次感染某一型登革病毒產(chǎn)生相應抗體后,再次感染其它型別的登革病毒時,抗體或亞中和活性抗體非但不能起到中和病毒的作用,反而與登革病毒顆粒結(jié)合形成抗原-抗體復合物,通過與單核細胞或巨噬細胞膜上的IgG的Fc受體(FcR)結(jié)合,進入到這些細胞內(nèi)進行繁殖,引起單核細胞系感染,隨即釋放出裂解補體C3的酶、血管通透因子和凝血活化酶,進而導致彌漫性血管內(nèi)凝血、休克等一系列病理過程,導致嚴重的DHF和DSS的發(fā)生。E蛋白構(gòu)成病毒顆粒的突起,具有介導病毒吸附、與宿主細胞膜融合、病毒組裝、誘發(fā)中和抗體產(chǎn)生保護性免疫等多種重要的生物學功能。按照功能的差異,登革病毒E蛋白又分為I、II、III三個功能區(qū)(envelopeproteindomain,ED)(也稱ED1、ED2、ED3),其中ED3具有免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu),是登革病毒與細胞受體結(jié)合的功能區(qū)域,決定著登革病毒感染的靶細胞種類,ED3結(jié)構(gòu)的突變也將導致病毒毒力的減弱或使病毒逃逸于機體的免疫中和效應。因此,對登革病毒ED3的研究也是近年來關(guān)注的熱點,通過對ED3的結(jié)構(gòu)和功能研究,將有助于理解登革病毒與其敏感細胞間的相互作用和致病的分子機制,為在不同細胞上登革病毒病受體的篩選鑒定、特異性診斷、疫苗研究和抗病毒藥物的設計等提供理論依據(jù)。本文就近年來國內(nèi)外登革病毒包膜ED3的研究進展綜述如下。1.denv3蛋白的結(jié)構(gòu)登革病毒包膜E蛋白由495～501個氨基酸殘基組成,分子量約為55～60kDa,現(xiàn)已獲得DENV2和DENV3E蛋白的晶體結(jié)構(gòu),結(jié)果顯示,登革病毒的E蛋白刺突是由兩個單體分子以反向平行方式構(gòu)成的同源二聚體,鑲嵌于成熟的登革病毒顆粒表面,每個登革病毒成熟顆粒又由180個這樣的同源二聚體E蛋白構(gòu)成了病毒的表面突起。E蛋白可形成3個不同的結(jié)構(gòu)域,呈β桶狀的ED1,位于E蛋白單體中央,也稱中心區(qū);呈指樣結(jié)構(gòu)的ED2,參E蛋白二聚體的形成和病毒與宿主細胞的融合過程;ED3由E蛋白C端的第303-395位氨基酸殘基構(gòu)成且延伸至病毒的最表面,含有大量天冬氨酸及堿性氨基酸,它具有免疫球蛋白IgG樣結(jié)構(gòu),其β桶狀結(jié)構(gòu)的中心軸與病毒表面垂直,并以一個15個氨基酸殘基的短鏈與ED1區(qū)相連。Volk等對DENV4的可溶性ED3蛋白晶體的X-ray研究發(fā)現(xiàn),ED3蛋白是一個由3組β片層排列成的β桶狀結(jié)構(gòu),第一組β片層頂端的外表面暴露于病毒顆粒表面,包括β1、β2、β5和β7F306-E314殘基位點(β1,凸起的309–312)\T320-Y326(β2),R350-I351(β5)a和V365-E370(β7),在一個E蛋白的二聚體中大約一半的這種片層結(jié)構(gòu)與ED2上相對的蛋白質(zhì)分子相結(jié)合。第二組β片層包括了β3和β6的殘基位點C333-K334(β3)和L357-A358(β6),這組片層的外表面與ED1相對。第三組β片層包括β4、β8和v9位點的氨基酸殘基F337-R340、D375-I380(β8)和L387-F392(β9),這組片層離病毒顆粒表面最遠(圖1)。所有的這三組β片層也存在于DENV2和DENV3的ED3蛋白結(jié)構(gòu)上,但β5不同,DENV3(R348-L349)和DENV4(R350-I351)病毒的β5只有兩個氨基酸長,而在DENV2上扭曲的β5(V347-L351)包含了N-末端上附加的三個氨基酸殘基(圖2)。在整個黃病毒屬中,β1-9片層編碼序列均高度保守,一個β片層穿過4個β片層,β8、β9穿過全部結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象在所有的黃病毒中均存在。Wang等在比較了森林動物登革病毒隔離株P(guān)75-215和人類登革病毒隔離株703-704后發(fā)現(xiàn),在ED3上有5個氨基酸殘基(K340R,M342V,I335T,I364V和A382V)的變異,推測這5個氨基酸殘基的保守性變異可能導致了登革病毒從蚊到猴子的傳播遷變?yōu)槲玫饺说膫鞑?也就是說人登革病毒的出現(xiàn),部分由于ED3上重要氨基酸的改變,進而使病毒的受體結(jié)合性質(zhì)發(fā)生了改變而造成的。2.denv2基因回復突變體的結(jié)構(gòu)及生物學特性病毒感染細胞的前提是吸附細胞,其本質(zhì)是病毒與細胞表面受體的特異性結(jié)合。現(xiàn)普遍認為ED3介導了病毒與細胞的結(jié)合,為細胞受體的結(jié)合位點,原因如下:ED3具有許多結(jié)合細胞受體特有的免疫球蛋白樣折疊;ED3具有的loop環(huán)結(jié)構(gòu)使它比ED1和ED2要遠離病毒表面;不同可溶形式的ED3蛋白已被證實可以阻斷西尼羅病毒和登革病毒對細胞的感染。運用分子單克隆抗體、酵母表面展示和對DENV2ED3的隨機誘變等技術(shù)方法,現(xiàn)已描繪出DENV2ED3的部分中和表位K310、I312、P332、L389和W391,用相應的單克隆抗體封閉這些表位后,可降低DENV2對其敏感細胞的感染。登革病毒在不同細胞上的受體研究一直是登革病毒研究的熱點之一,目前認為DENV受體包括蛋白質(zhì)類、糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)、硫酸乙酰肝素(heparansulfate,HS)和與脂多糖連接的CD14相關(guān)分子等,其均與病毒和細胞的吸附有關(guān),而由ED3參與的受體主要為GAG、HS和一些蛋白質(zhì)分子。GAG是由二糖重復單位(氨基己糖、己糖醛酸或半乳糖)組成的線性雜多糖,其重復二糖骨架的化學結(jié)構(gòu)廣泛分布于多種哺乳動物細胞系中,如Vero、CHO等。Rostand等發(fā)現(xiàn)DENV2的吸附與病毒和表達在基質(zhì)及細胞膜上的GAG結(jié)合有關(guān)。通過對其結(jié)合的序列分析得出:為于I區(qū)側(cè)面、III區(qū)終端的E284-310位氨基酸和位于Ⅲ區(qū)尾部的E386-411位氨基酸具有2個GAG結(jié)合區(qū),能夠與細胞表面的GAG結(jié)合。實驗證實用GAG裂解酶除去Vero細胞上的GAG后,病毒與細胞的結(jié)合率下降;DENV2與GAG表達缺陷的CHO細胞的結(jié)合率也比野生型有大幅下降。但其它GAG的細胞系仍容易被黃病毒感染,說明黃病毒與GAG的結(jié)合并不是病毒進入這些細胞所必需的,但它們的結(jié)合仍有助于病毒的聚集,從而促進病毒與宿主細胞表面更特異的受體結(jié)合。硫酸乙酰肝素(HS)是一類廣泛存在于細胞表面及基質(zhì)中的高度硫酸化的氨基葡聚糖,表面具有大量負電荷,具有介導病原體吸附等多種生物學功能。研究發(fā)現(xiàn)ED3的284-310位和386-411位可能為HS的結(jié)合區(qū)。HS的硫酸化對E蛋白與受體的結(jié)合是必需的,如用含硫酸化抑制劑的培養(yǎng)基培養(yǎng)Vero細胞,細胞存活并不受影響,但在很大程度上抑制了其與E蛋白的結(jié)合。但Martinez-Barragan等發(fā)現(xiàn),Vero細胞上另一種糖蛋白也與DENV的吸附相關(guān),并且不受HS影響,提示還有其他高親和的受體存在,病毒與受體的結(jié)合并非單一分子,且不同細胞發(fā)揮受體作用的分子也不盡相同。近年來,運用VOPBA和質(zhì)譜等技術(shù)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了一些DENV易感細胞上與DENV吸附有關(guān)的蛋白質(zhì)分子,推測為DENV的受體分子,如白紋伊蚊細胞上的40kDa、45kDa、67kDa、80kDa蛋白質(zhì),人巨噬細胞上的HSP70/HSP90等。最近,Kuadkitkan等利用2D-VOPBA和質(zhì)譜技術(shù)在DENV2感染的C6/36細胞上發(fā)現(xiàn)了抗增殖蛋白(prohibitin,PHB)受體,PHB基因是一種有效的腫瘤抑制基因,廣泛分布于不同種屬的各種生物細胞中,對細胞代謝、生長、分化、衰老以及凋亡等諸多方面發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。通過抗體感染抑制實驗發(fā)現(xiàn),PHB的單克隆抗體可抑制DENV對C6/36細胞的感染,推測是PHB的單克隆抗體封閉了PHB受體,從而抑制了病毒的吸附;進一步的CO-IP實驗表明,PHB可與DENV2E蛋白發(fā)生特異性的結(jié)合,證實了PHB為DENV2在C6/36細胞上特異性受體。運用同樣的方法,Jindadamrongwech等在DENV2感染的HepG2細胞上發(fā)現(xiàn)了90kDa的葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78[glucoseregulatedprotein78,GRP78(Bip)],它是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白,能在多種細胞表面表達,可結(jié)合DENV2ED3介導病毒的入侵;Thepparit等在相同的細胞上發(fā)現(xiàn)了37/67kDa的層黏連蛋白受體,37kDa是蛋白前體,二聚體?；癁?7kDa的成熟蛋白受體,它作為一種非整聯(lián)蛋白性質(zhì)的蛋白受體分子,介導細胞與層黏連蛋白的相互作用,運用該受體的單克隆抗體或重組表達的蛋白質(zhì)處理的HepG2細胞可抑制DENV1的感染,證實其為DENV1的特異性受體。3.denv1與質(zhì)膜融合的機制病毒的感染過程包括病毒的吸附-穿入-脫殼-基因組復制-病毒顆粒的組裝和釋放。登革病毒與細胞表面受體結(jié)合后,必須完成病毒包膜與宿主細胞膜的融合過程,才能將核衣殼釋放到細胞質(zhì)中,啟動病毒的復制與增殖過程。不同于其它通過融合蛋白與細胞受體或共受體結(jié)合引發(fā)的病毒融合過程,登革病毒的膜融合過程是由E蛋白介導的病毒被內(nèi)吞到內(nèi)含體中,由內(nèi)吞體中的酸性pH條件所觸發(fā)的病毒包膜與細胞質(zhì)膜的融合過程。包膜ED3在介導病毒與宿主受體的融合中具有重要的功能。在中性和微堿性的條件下,成熟病毒體表面的E蛋白以反向平行構(gòu)成的同源二聚體的形式存在,ED2的融合肽被ED1的糖側(cè)鏈所封閉。病毒感染宿主細胞,包膜ED3蛋白與宿主細胞表面特異性受體結(jié)合,發(fā)生受體介導的內(nèi)吞作用,病毒進入細胞的內(nèi)含體,酸性的內(nèi)含體環(huán)境觸發(fā)E蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生重排,由二聚體解聚重排成呈發(fā)卡結(jié)構(gòu)的三聚體,ED3從E蛋白的末端回折深入到ED1與ED2形成的狹縫處,ED2暴露出疏水的融合肽,并以融合肽插入質(zhì)膜的方式將E蛋白錨定于質(zhì)膜上,這種變構(gòu)傳遞給病毒包膜結(jié)合宿主細胞膜時所需的能量。然后,E蛋白自身回折拉近與其N端融合肽相連的質(zhì)膜和與跨膜區(qū)相連的病毒包膜的距離,最終完成膜的融合(圖3)。Nayak等在對DENV1與質(zhì)膜融合過程的研究中發(fā)現(xiàn),其E蛋白結(jié)構(gòu)域ED1和結(jié)構(gòu)域ED3之間的界面上存在一個由4個極性氨基酸殘基組成的束狀結(jié)構(gòu),其中兩個殘基His-282和His-317是DENV1所獨有的,能在內(nèi)含體低pH條件下觸發(fā)E蛋白構(gòu)象改變。其中,His-317是關(guān)鍵部分,可在低pH時破壞結(jié)構(gòu)域ED1和結(jié)構(gòu)域ED3之間的界面并加固融合后E蛋白三聚體在對內(nèi)含體pH降低時作出反應,觸發(fā)融合構(gòu)象的改變。結(jié)構(gòu)域ED1和結(jié)構(gòu)域ED3之間的界面出現(xiàn)的這種極化束狀結(jié)構(gòu)說明,DENV1E蛋白三聚體比DENV2E蛋白三聚體更加穩(wěn)固,也就是說如果要使DENV1發(fā)生融合,需要更低的pH值。4.fgloop基因病毒的毒力是指病毒的侵襲力和誘發(fā)細胞病變引起炎癥的能力,其影響因素很多,凡能影響病毒生活周期的因素均可影響病毒的毒力。有研究者通過感染性cDNA克隆定點突變、中和逃逸突變株和由感染性cDNA克隆構(gòu)建的病毒嵌合體等方法,確定了E蛋白上不同的病毒毒力決定簇,并按區(qū)域進行了劃分,如連接ED1和ED2區(qū)的極性鉸鏈區(qū)、prM與E蛋白的交界處、融合肽、E蛋白的糖基化位點和ED3區(qū)等。由于包膜ED3主要參與病毒與細胞受體的結(jié)合,它的改變將影響病毒對靶細胞的識別,因此作為一個重要的毒力決定簇而引起人們關(guān)注。登革病毒包膜ED3區(qū)外側(cè)F和Gβ-片層之間有個環(huán)狀結(jié)構(gòu),稱FGloop,它含有保守的Arg-GlyAsp(RGD)模體,是公認的結(jié)合素類受體,如纖連蛋白III型受體,它的突變將影響病毒與細胞表面糖胺聚糖類分子的結(jié)合,導致E蛋白發(fā)生錯誤折疊,未折疊的E蛋白停留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi),延遲病毒顆粒的組裝,從而降低了病毒滴度,減弱了病毒的侵襲力。Erb等利用DENV2感染性cDNA克隆定點突變的方法,研究了FGloopAAS381-386序列突變、缺失株對C6/36、Vero、HepG2細胞及伊蚊的感染影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)FGloopAAS381-386序列突變、缺失株仍可在C6/36細胞中進行感染和穩(wěn)定復制,而在伊蚊和哺乳動物細胞中只能進行初步感染,復制的子代病毒序列會發(fā)生突變,不能穩(wěn)定復制,也就是說FGloop是登革病毒在伊蚊和哺乳動物細胞中增殖所必需的,進一步的抗體阻斷實驗發(fā)現(xiàn),運用特異性3H5單克隆抗體阻斷FGloop位點后,登革病毒感染細胞的能力下降,證實FGloop是登革病毒抗體特異的結(jié)合位點,它的突變將大大影響病毒對其敏感細胞的毒性。在對