醫(yī)療器械無菌檢驗供試品數(shù)量、培養(yǎng)基、適用性檢查、對照試驗

附件1常見的名詞解釋1．滅菌：經(jīng)確認的使產(chǎn)品無存活微生物的過程。目前國際上規(guī)定，滅菌過程必須使物品污染微生物存活概率減少到10-6及以下。2．微生物：在顯微鏡下才能看到的微小實體，包括細菌、真菌、原生動物和病毒。3．無菌技術(shù)：是指在微生物試驗工作中，控制或防止各類微生物的污染及其干擾的一系列操作方法和有關(guān)措施，其中包括無菌環(huán)境設(shè)施、無菌檢驗器材以及無菌操作。4．無菌操作：是指在無菌環(huán)境條件下，在對無菌制品或無菌器械進行檢驗的過程中，能防止微生物污染與干擾的一種常規(guī)操作方法。5．培養(yǎng)條件：促進微生物復(fù)蘇、生長和（或）繁殖所采用的生長培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法的組合，培養(yǎng)方法可包括溫度、時間和其他規(guī)定用于培養(yǎng)的條件。6．需氧微生物：需要氧氣進行代謝的微生物。7．厭氧微生物：不需要氧氣進行代謝的微生物。8．抑細菌/抑霉菌試驗：用選定的微生物來演示某些物質(zhì)的存在能夠抑制這些微生物的繁殖。9．促生長試驗：為了證明一種培養(yǎng)基能夠支持微生物繁殖而進行的技術(shù)操作。10．假陰性：實際陽性的無菌檢驗結(jié)果被變成了陰性。11．假陽性：實際陰性的無菌檢驗結(jié)果被變成了陽性。12．生物指示物：對規(guī)定的滅菌過程有特定的抗力，含有活微生物的測試系統(tǒng)。13．化學(xué)指示物：根據(jù)暴露于某一滅菌過程所產(chǎn)生的化學(xué)或物理變化，顯現(xiàn)一個或多個預(yù)定過程變量變化的測試系統(tǒng)。14．無菌保證水平（SAL）：滅菌后產(chǎn)品上存在單個活微生物的概率。15．表面活性劑：改變?nèi)芤罕砻婺埽ū砻鎻埩Γ┑某煞帧?6．中和劑：有抑菌成分中和能力的化學(xué)有效成分。17．滅活劑：對抑菌成分有滅活能力的化學(xué)有效成分。18．潔凈區(qū)：需要對環(huán)境中塵粒及微生物數(shù)量進行控制的房間（區(qū)域），其建筑結(jié)構(gòu)、裝備及其使用應(yīng)當能夠減少該區(qū)域內(nèi)污染物的引入、產(chǎn)生和滯留。附件2供試品數(shù)量的選擇檢驗數(shù)量是指一次試驗所用供試品最小包裝容器的數(shù)量。除另有規(guī)定外，出廠產(chǎn)品按中國藥典2020版四部通則1101中表1規(guī)定，上市產(chǎn)品監(jiān)督檢驗按表2規(guī)定。表1、表2中最少檢驗數(shù)量不包括陽性對照試驗的供試品用量。執(zhí)行GB/T14233系列標準的供試品數(shù)量應(yīng)滿足標準中對于檢驗樣品數(shù)量的要求。檢驗量是指供試品每個最小包裝接種至每份培養(yǎng)基的最小量。除另有規(guī)定外，每份培養(yǎng)基接種的供試品量按中國藥典2020版四部通則1101中表3規(guī)定。若每支（瓶）供試品的裝量按規(guī)定足夠接種兩份培養(yǎng)基，則應(yīng)分別接種硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基。采用薄膜過濾法時，只要供試品特性允許，應(yīng)將所有容器內(nèi)的全部內(nèi)容物過濾。表1批出廠產(chǎn)品最少量檢驗數(shù)量供試品批產(chǎn)量N（個）接種每種培養(yǎng)基的最少檢驗數(shù)量注射劑≤100100＜N≤500＞50010%或4個（取較多者）10個2%或20個（取較少者）大體積注射劑（＞100mL）2%或10個（取較少者）眼用及其他非注射產(chǎn)品≤200＞2005%或2個（取較多者）10個桶裝無菌固體原料≤44＜N≤50＞50每個容器20%或4個容器（取較多者）2%或10個容器（取較多者）醫(yī)療器械≤100100＜N≤500＞50010%或4件（取較多者）10件2%或20件（取較少者）注：若每個容器中的裝量不足接種兩種培養(yǎng)基，那么表中最少檢驗數(shù)量應(yīng)增加相應(yīng)倍數(shù)。表2上市抽驗樣品的最少檢驗數(shù)量供試品供試品最少檢驗數(shù)量（瓶或支）液體制劑固體制劑血液制品V＜50mLV≥50mL醫(yī)療器械10106210注：1.若每個容器中的裝量不足接種兩種培養(yǎng)基，那么表中的最少檢驗數(shù)量應(yīng)加倍增加相應(yīng)倍數(shù)。2.桶裝固體原料的最少檢驗數(shù)量為4個包裝。表3供試品的最少檢驗量供試品供試品裝量每支樣品接入每種培養(yǎng)基的最少量液體制劑V＜1mL1mL≤V≤40mL40mL＜V≤100mLV＞100mL全量半量，但不得少于1mL20mL10%，但不得少于20mL固體制劑M＜50mg50mg≤M＜300mg300mg≤M≤5gM＞5g全量半量，但不得少于50mg150mg500mg醫(yī)療器械外科用敷料棉花及紗布取100mg或1cm×3cm縫合線、一次性醫(yī)用材料整個材料①帶導(dǎo)管的一次性醫(yī)療器械（如輸液袋）二分之一內(nèi)表面積其他醫(yī)療器械整個器具①（切碎或拆散開）注：①如果醫(yī)療器械體積過大培養(yǎng)及用量可在2000mL以上，將其完全浸沒。

附件3培養(yǎng)基的制備培養(yǎng)應(yīng)注意培養(yǎng)條件：硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（30～35）℃14天；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（20～25）℃14天。選擇培養(yǎng)條件需考慮的因素：產(chǎn)品的性質(zhì)、制造方法、潛在的微生物污染來源、可能遇到的微生物種類。硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基必須在煮沸后，再進行分裝、滅菌。1．硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基胰酪胨15.0g、酵母浸出粉5.0g、葡萄糖/無水葡萄糖5.5g/5.0g、氯化鈉2.5g、L-胱氨酸0.5g、新配制的0.1%刃天青溶液1.0mL、硫乙醇酸鈉0.5g（或硫乙醇酸0.3mL）、瓊脂0.75g、水1000mL除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH為弱堿性，煮沸，濾清，加入葡萄糖和刃天青溶液，搖勻，調(diào)節(jié)pH，使滅菌后在25℃的pH值為7.1±0.2。分裝至適宜的容器中，其裝量與容器高度的比例應(yīng)符合培養(yǎng)結(jié)束后培養(yǎng)基氧化層（粉紅色）不超過培養(yǎng)基深度的1/2。滅菌。在供試品接種前，培養(yǎng)基氧化層的高度不得超過培養(yǎng)基深度的1/3，否則，須經(jīng)100℃水浴加熱至粉紅色消失（不超過20分鐘），迅速冷卻，只限加熱一次，并防止被污染。除另有規(guī)定外，硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基置（30～35）℃培養(yǎng)。2．胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基胰酪胨17.0g、氯化鈉5.0g、大豆木瓜蛋白酶水解物3.0g、磷酸氫二鉀2.5g、葡萄糖/無水葡萄糖2.5g/2.3g、水1000mL除葡萄糖外，取上述成分，混合，微溫溶解，濾過，調(diào)節(jié)pH使滅菌后在25℃的pH值為7.3±0.2，加入葡萄糖，分裝，滅菌。胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基置（20～25）℃培養(yǎng)。3．中和或滅活用培養(yǎng)基按上述硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基的處方及制法，在培養(yǎng)基滅菌或使用前加入適宜的中和劑、滅活劑或表面活性劑，其用量同方法適用性試驗。4．0.5%葡萄糖肉湯培養(yǎng)基（用于硫酸鏈霉素等抗生素的無菌檢驗）胨10.0g、氯化鈉5.0g、牛肉浸出粉3.0g、葡萄糖5.0g、水1000mL。除葡萄糖外，取上述成分混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH為弱堿性，煮沸，加入葡萄糖溶解后，搖勻，濾清，調(diào)節(jié)pH使滅菌后在25℃的pH值為7.2±0.2，分裝，滅菌。5．胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基胰酪胨15.0g、氯化鈉5.0g、大豆木瓜蛋白酶水解物5.0g、瓊脂15.0g、水1000mL。除瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH使滅菌后在25℃的pH值為7.3±0.2，加入瓊脂，加熱溶化后，搖勻，分裝，滅菌。6．沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基動物組織胃蛋白酶水解物和胰酪胨等量混合物10.0g、葡萄糖20.0g、水1000mL。除葡萄糖外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH使滅菌后在25℃的pH值為5.6±0.2，加入葡萄糖，搖勻，分裝，滅菌。7．沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基動物組織胃蛋白酶水解物和胰酪胨等量混合物 10.0g、瓊脂15.0g、葡萄糖40.0g、水1000mL。除葡萄糖、瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH使滅菌后在25℃的pH值為5.6±0.2，加入瓊脂，加熱溶化后，再加入葡萄糖，搖勻，分裝，滅菌。8．馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）馬鈴薯(去皮)200g、瓊脂14.0g、葡萄糖20.0g、水1000mL。取馬鈴薯，切成小塊，加水1000mL，煮沸20～30分鐘，用6～8層紗布過濾，取濾液補水至1000mL，調(diào)節(jié)pH使滅菌后在25℃的pH值為5.6±0.2，加入瓊脂，加熱溶化后，再加入葡萄糖，搖勻，分裝，滅菌。

附件4培養(yǎng)基的適用性檢查1．無菌性檢查每批培養(yǎng)基一般隨機取不少于5支（瓶），置各培養(yǎng)基規(guī)定的溫度培養(yǎng)14天，應(yīng)無菌生長。2．靈敏度檢查菌種：培養(yǎng)基靈敏度檢查所用的菌株傳代次數(shù)不得超過5代（從菌種保存中心獲得的干燥菌種為第0代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)進行保存和確認，以保證試驗菌株的生物學(xué)特性。所用菌株包括：金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）[CMCC（B）26003]、銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa）[CMCC（B）10104]、枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）[CMCC（B）63501]、生孢梭菌（Clostridiumsporogenes）[CMCC（B）64941]、白色念珠菌（Candidaalbicans）[CMCC（F）98001]、黑曲霉（Aspergillusniger）[CMCC（F）98003]。3．菌液制備接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上，接種生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，（30～35）℃培養(yǎng)18～24小時；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，（20～25）℃培養(yǎng)2～3天，上述培養(yǎng)物用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度菌懸液。接種黑曲霉至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基或馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，（20～25）℃培養(yǎng)5～7天或直到獲得豐富的孢子，加入適量含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，采用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的孢子懸液。菌懸液若在室溫下放置，一般應(yīng)在2小時內(nèi)使用，若保存在（2～8）℃可在24小時內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液可保存在（2～8）℃，在驗證過的貯存期內(nèi)使用。4．培養(yǎng)基接種取適宜裝量的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基7支，分別接種不大于100cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌各2支，另1支不接種作為空白對照；取適宜裝量的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基7支，分別接種不大于100cfu的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接種作為空白對照。接種細菌的培養(yǎng)管培養(yǎng)時間不超過3天，接種真菌的培養(yǎng)管培養(yǎng)時間不得超過5天。5．結(jié)果判定空白對照管應(yīng)無菌生長，若加菌的培養(yǎng)基管均生長良好，判該培養(yǎng)基的靈敏度檢查符合規(guī)定。附件5方法適用性試驗1．菌種及菌液制備金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌株及菌液制備同培養(yǎng)基靈敏度檢查。大腸埃希菌（Escherichiacoli）[CMCC（B）44102]的菌液制備同金黃色葡萄球菌。2．薄膜過濾法按供試品的無菌檢驗要求，取每種培養(yǎng)基規(guī)定接種的供試品總量，采用薄膜過濾法過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入不大于100cfu的試驗菌，過濾。加培養(yǎng)基至濾筒內(nèi)，接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、生孢梭菌的濾筒內(nèi)加硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基；接種枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉的濾筒內(nèi)加胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基。另取一裝有同體積培養(yǎng)基的容器，加入等量試驗菌，作為對照。置規(guī)定溫度培養(yǎng)，培養(yǎng)時間不得超過5天。3．直接接種法取符合直接接種法培養(yǎng)基用量要求的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基6管，分別接入不大于100cfu的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、生孢梭菌各2管，取符合直接接種法培養(yǎng)基用量要求的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基6管，分別接入不大于100cfu的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各2管。其中1管按供試品的無菌檢驗要求，接入每支培養(yǎng)基規(guī)定的供試品接種量，另1管作為對照，置規(guī)定的溫度培養(yǎng)，培養(yǎng)時間不得超過5天。4．結(jié)果判斷與對照管比較，如含供試品各容器中的試驗菌均生長良好，則說明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計，照此檢查方法和檢查條件進行供試品的無菌檢驗。如含供試品的任一容器中的試驗菌生長微弱、緩慢或不生長，則說明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下有抑菌作用，可采用增加沖洗量、增加培養(yǎng)基的用量、使用中和劑或滅活劑、更換濾膜品種等方法，消除供試品的抑菌作用，并重新進行方法適用性試驗。方法適用性試驗也可與供試品的無菌檢驗同時進行。

附件6供試品處理及接種培養(yǎng)基直接接種法：即取規(guī)定量供試品分別等量接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中。除另有規(guī)定外，每個容器中培養(yǎng)基的用量應(yīng)符合接種的供試品體積（采用洗脫法時，應(yīng)為洗脫液體積）不得大于培養(yǎng)基體積的10%，同時，硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基每管裝量不少于15mL，胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基每管裝量不少于10mL。薄膜過濾法：將供試液混勻，過濾。如供試品具有抑菌作用或含防腐劑，須用適量的沖洗液沖洗濾膜，沖洗次數(shù)不得少于三次。沖洗后，如用封閉式薄膜過濾器，分別將100mL硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基加入相應(yīng)的濾筒內(nèi)。薄膜過濾法應(yīng)優(yōu)先采用封閉式薄膜過濾器，無菌檢驗用的濾膜孔徑應(yīng)不大于0.45μm。直徑