臂旁內(nèi)側(cè)核向感覺傳遞的順行追蹤技術(shù)

臂旁內(nèi)側(cè)核向感覺傳遞的順行追蹤技術(shù)

臂側(cè)核（pbn）是圍繞著小腦足部周圍的神經(jīng)組成的，可分為三個部分：臂側(cè)核（pbl）、臂側(cè)核（pbm）和kf核。PBN的功能非常復(fù)雜,主要與呼吸調(diào)節(jié)、心血管活動和味覺等內(nèi)臟活動和感覺信息的傳導(dǎo)有關(guān)。PBN具有廣泛的纖維聯(lián)系,Saper在最近的一篇綜述中對其進行了系統(tǒng)總結(jié),指出PBN向丘腦發(fā)出投射的神經(jīng)元僅位于PBL的內(nèi)外側(cè)亞核(internallateralsubnucleus,IL),且IL也僅向丘腦板內(nèi)核群投射。丘腦內(nèi)接受軀體感覺信息(包括傷害性信息)的特異性核團主要是丘腦腹后內(nèi)側(cè)核(VPM)和丘腦腹后外側(cè)核(VPL),此二核合稱丘腦腹基底復(fù)合體(VBC)。三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核(Vc)和脊髓背角淺層是軀體傷害性刺激信息傳遞的初級門戶。近年的研究證實PBN也是Vc和脊髓背角淺層上行投射神經(jīng)元的重要中繼站,在軀體傷害性刺激信息向高級中樞傳遞過程中發(fā)揮重要作用。由于觀察PBN是否向VPM投射對深入闡明面口部傷害性刺激信息的傳遞和調(diào)控有重要的意義,故本研究用四甲基羅達明(TMR)或辣根過氧化物酶(HRP)逆行標(biāo)記和生物素葡聚糖胺(BDA)順行追蹤技術(shù),對PBN向VPM的上行投射及其終止部位進行了觀察。逆標(biāo)免疫組化SD大鼠24只,體重200～250g,雌雄不拘,分為3組,每組8只。第1、2組動物經(jīng)戊巴比妥鈉腹腔麻醉(40mg/kg)后開顱,將0.1μl的10%TMR(第1組)或0.05～0.1μl的30%HRP(第2組)分別定向注入右側(cè)VPM。注射坐標(biāo)為(mm):冠矢點后3.7～3.8,旁開2.4～2.5,進針深度6.3～6.4。注射用尖端粘外徑為50～80μm微玻管的1μlHamilton微量注射器,注射時間為15～20min,注畢留針15min。動物存活4d后用過量戊巴比妥鈉深麻,開胸,經(jīng)心臟插管至升主動脈。先用0.9%鹽水100ml沖凈血液,再分別用含4%多聚甲醛的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(PB,pH7.4)500ml(第1組)或含1%多聚甲醛和1.25%戊二醛的0.1mol/LPB500ml(第2組)灌注固定。注畢立即取腦,后固定4～6h,再移入30%蔗糖中至沉底(4℃)。將注射部位和腦橋吻段冠狀凍切,片厚30μm,隔3張取1張,分4套收集于0.01mol/LPBS中(pH7.3)。將第1組動物的第1套切片裱于載片上,在熒光顯微鏡下觀察注射區(qū)和PBN內(nèi)的TMR逆標(biāo)情況。選擇注射區(qū)位于VPM內(nèi)且PBN內(nèi)有逆標(biāo)神經(jīng)元的動物的第2套切片,用ABC法進行TMR免疫組織化學(xué)染色:(1)切片入豚鼠IgG抗TMR血清(1∶1000,日本京都大學(xué)醫(yī)學(xué)部金子武嗣先生惠贈)中孵育18～24h;(2)Biotin標(biāo)記的驢抗豚鼠IgG血清(1∶200,Jackson)中孵育3h;(3)ABC混合液(1∶50,Vector)中孵育1h。孵育均在室溫進行?？贵w和復(fù)合物的稀釋均用含0.3%的TritonX-100和5%正常馬血清的PBS。PBS徹底清洗切片后,用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)、硫酸鎳胺和H2O2呈色。裱片,中性紅復(fù)染,脫水、透明、封片、光鏡觀察。將第1組動物的第3套切片丟棄。第2組動物的第1套切片經(jīng)洗滌液(0.1mol/LPB,pH7.0)漂洗后,用硝普鈉作穩(wěn)定劑的TMB法呈色,其余處理同第1組。第3組動物麻醉后,用尖端粘微玻管的微量注射器將0.1μl的10%BDA水溶液緩慢注入左側(cè)PBN。動物存活3d后深麻、開胸,先用0.9%的鹽水沖凈血液,再用500ml含4%多聚甲醛和0.05%戊二醛的PB灌注固定。注畢立即取腦,后固定3～6h;再移入30%蔗糖至沉底(4℃)。在腦橋右側(cè)做標(biāo)記,將PBN注射區(qū)及丘腦冠狀凍切,片厚30μm,隔3張取1張,分4套收集于PBS中。先用PBS清洗第1套切片,再將切片置入含0.3%的TritonX-100和5%正常羊血清的PBS中孵育2h,次入ABC混合液中孵育3h,最后用硫酸鎳胺加強的DAB法呈色。其余處理同第1組。將第1～3組動物的第4套切片行Nissl染色,以便對照觀察。tmr逆標(biāo)神經(jīng)元的分布每組動物中均選擇TMR和HRP注射區(qū)準(zhǔn)確位于VPM和BDA注射區(qū)準(zhǔn)確位于PBN的大鼠進行觀察。第1組8只動物中,經(jīng)免疫組織化學(xué)染色證實5只大鼠的TMR注射區(qū)位于VPM。將TMR注入右側(cè)VPM后,PBN內(nèi)的TMR逆標(biāo)神經(jīng)元主要位于注射區(qū)同側(cè)的PBL和KF核,PBM內(nèi)的TMR逆標(biāo)神經(jīng)元較少(圖1～3),而對側(cè)PBN內(nèi)僅偶見TMR逆標(biāo)神經(jīng)元。5只大鼠第2套切片上注射區(qū)同側(cè)PBL、KF核、PBM和注射區(qū)對側(cè)PBL、KF核、PBM內(nèi)TMR逆標(biāo)神經(jīng)元的平均數(shù)量分別為3257、2186、892和141、85、34。高倍鏡下觀察,PBL內(nèi)的TMR逆標(biāo)神經(jīng)元多呈梭形或三角形,少數(shù)神經(jīng)元呈多突形,胞體直徑20～30μm,少數(shù)多突形神經(jīng)元有明顯的長突起(圖2)。KF核內(nèi)TMR逆標(biāo)神經(jīng)元大小均一,分布均勻,胞體直徑多為15～20μm,胞體多呈三角形或卵圓形,突起較明顯(圖3)。PBM內(nèi)的TMR逆標(biāo)神經(jīng)元大小不一,多呈梭形或三角形,胞體長徑10～20μm,短徑5～10μm,部分逆標(biāo)神經(jīng)元呈有多個突起的圓形,胞體直徑10～20μm(圖2)。PBL的內(nèi)外側(cè)亞核(IL)中也可見一些淡染的TMR逆標(biāo)神經(jīng)元(已計入PBL的逆標(biāo)神經(jīng)元總數(shù)),細胞呈小圓形,直徑10～15μm,分布均勻,很少見突起(圖4)。此外,在小腦上腳內(nèi)也能見到少許TMR逆標(biāo)神經(jīng)元(圖1,2)。第2組8只動物中,經(jīng)TMB呈色后證實6只大鼠的HRP注射區(qū)位于VPM,HRP注射區(qū)可見較明顯的中心區(qū)及擴散區(qū)。HRP逆標(biāo)神經(jīng)元多位于內(nèi)側(cè)PBN,對側(cè)較少見,HRP逆標(biāo)神經(jīng)元主要位于PBL、KF核及PBM(圖5),其分布特點和形態(tài)學(xué)特征與TMR逆標(biāo)神經(jīng)元相似。6只大鼠第1套切片注射區(qū)同側(cè)PBL、KF核、PBM和注射區(qū)對側(cè)PBL、KF核、PBM內(nèi)TMR逆標(biāo)神經(jīng)元的平均數(shù)量分別為2985、1763、596和118、53、17。HRP逆標(biāo)神經(jīng)元的平均數(shù)量少于TMR逆標(biāo)神經(jīng)元的平均數(shù)量。第3組8只動物中,經(jīng)DAB呈色證實4只大鼠的BDA注射區(qū)位于左側(cè)PBN。BDA順標(biāo)纖維和終末密集地分布于同側(cè)VPM和丘腦腹后外側(cè)核(VPL)內(nèi)(圖6),對側(cè)VPM和VPL內(nèi)也能見到中等密度的BDA順標(biāo)纖維和終末(圖7)。VPM內(nèi)BDA順標(biāo)纖維和終末的分布區(qū)基本上與VPM內(nèi)TMR和HRP的注射區(qū)重疊。此外,在同側(cè)的丘腦膠狀質(zhì)核(SM)(圖8)和丘腦后核(PO)內(nèi)可見中等密度的BDA順標(biāo)纖維和終末。高倍鏡下可見BDA順標(biāo)纖維呈串珠狀,有較多的膨體,其終末呈點狀(圖6～8)。hrp和丘腦vpm的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)較早的研究僅觀察到PBN向丘腦內(nèi)板內(nèi)核團投射。機能學(xué)研究證實PBN是味覺和內(nèi)臟感覺信息傳導(dǎo)路的中繼站,與血管活動和呼吸調(diào)節(jié)等也有密切關(guān)系。但隨著對PBN研究的不斷深入,人們發(fā)現(xiàn)大量軀體感覺信息也傳入PBN,如與面口部軀體傷害性信息傳遞有關(guān)的三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核(Vc)的神經(jīng)元向PBN投射,這些結(jié)果提示PBN在軀體感覺信息(特別是軀體傷害性信息)的傳遞過程中起重要作用。本研究用逆行和順行標(biāo)記技術(shù)發(fā)現(xiàn)主要參與內(nèi)臟活動調(diào)控和內(nèi)臟感覺信息傳遞的PBN向丘腦內(nèi)軀體感覺信息的特異性中繼核——丘腦VPM投射,此結(jié)果為從機能上進一步探索PBN在軀體感覺信息(特別是軀體傷害性信息)的傳遞和調(diào)控過程中的作用,提供了新的形態(tài)學(xué)資料。神經(jīng)束路追蹤技術(shù)對示蹤劑的基本要求是注射區(qū)局限、追蹤的靈敏度高、追蹤結(jié)果便于觀察和保存。為了確認(rèn)逆行追蹤結(jié)果的可靠性,還常常需要用順行追蹤方法來驗證,反之亦然。本研究首先用TMR和HRP兩種逆行示蹤劑觀察了PBN向丘腦VPM的上行投射,又用BDA順行追蹤方法驗證了TMR和HRP逆行追蹤的結(jié)果。在丘腦VPM內(nèi)TMR和HRP的注射部位和擴散范圍基本一致的情況下,從逆標(biāo)神經(jīng)元的計數(shù)結(jié)果來看,TMR的逆標(biāo)結(jié)果優(yōu)于HRP的逆標(biāo)結(jié)果。TMR是最近開發(fā)的熒光素示蹤劑,其主要組成部分是羅達明(rhodamine),在保持了羅達明比較敏感、不易被過路纖維吸收、可用熒光顯微鏡直接觀察和不易退色的優(yōu)點外,還可用TMR的特異性抗體進行免疫熒光或免疫組織化學(xué)染色,染色后不僅更易顯示TMR標(biāo)記神經(jīng)元的突起,而且便于保存、免疫熒光雙標(biāo)染色及電鏡觀察,但不足之處是在電鏡水平TMR的DAB反應(yīng)產(chǎn)物與其他免疫組織化學(xué)染色的反應(yīng)產(chǎn)物不易區(qū)別。HRP是最有效的示蹤劑之一,HRP催化TMB反應(yīng)后形成的形態(tài)獨特的針狀結(jié)晶,使HRP常被用于電鏡水平的束路追蹤研究,但注射區(qū)易擴散和不易判定、敏感性較低、過路纖維吸收、反應(yīng)過程較復(fù)雜和產(chǎn)物不穩(wěn)定是HRP追蹤方法的缺點。生物素葡聚糖胺(biotinylateddextranamine,BDA)也是近年開發(fā)的順行追蹤劑,其主要成分是生物素(biotin),按照ABC法的原理,用標(biāo)記熒光素或酶的卵白素(avidin)經(jīng)孵育與BDA結(jié)合后,可以直接用熒光顯微鏡觀察或經(jīng)組織化學(xué)反應(yīng)后在光鏡、電鏡下觀察。根據(jù)實驗要求,BDA可以選擇壓力或電泳的方式注入特定的核團。由于BDA的分子量(約3000)較小,3～5d即可被運輸?shù)胶芗毜妮S突分支和終末部位,較好地顯示投射纖維的終末形態(tài)和終止部位。與現(xiàn)在的主要順行示蹤劑PHA-L相比,BDA具有注入途徑多、運輸時間短、顯示過短簡單等優(yōu)點,但壓力注射時注射區(qū)易擴散是其不足。經(jīng)典的神經(jīng)解剖學(xué)理論認(rèn)為丘腦腹后內(nèi)側(cè)核(VPM)主要接受三叉丘系的傳入投射,三叉丘系的上行投射纖維還終止在丘腦內(nèi)板內(nèi)核團、SM、PO等部位,再由這些核團發(fā)生纖維投射至大腦皮質(zhì)軀體感覺代表區(qū)。隋鴻錦等觀察到貓丘腦VPM內(nèi)的突觸形式以軸-樹突觸為主,同時還存在少量軸-體突觸、樹-樹突觸和軸-軸-樹連續(xù)性突觸,一般認(rèn)為軸-軸-樹連續(xù)性突觸是突觸前抑制的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。在VPM可見以樹突為中心的匯聚型突觸復(fù)合體,在中央樹突的周圍同時有3個以上的突觸前成分與之形成突觸,這些復(fù)合體是丘腦VPM接受各種信息的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。至于丘腦VPM的終末來源,所見報道文獻較少。丘腦VPM內(nèi)含圓形小泡的小軸突(SR)終末的來源,目前有兩種觀點:Jones認(rèn)為全部SR終末均是大腦皮質(zhì)神經(jīng)元的軸突終末,但Guillery等則認(rèn)為只有部分SR終末發(fā)自皮質(zhì)神經(jīng)元。Peschanski等的研究證明大鼠丘腦VPM內(nèi)含圓形小泡的大軸突(LR)終末來自三叉丘系。丘腦VPM內(nèi)含扁平小泡的軸突(F)終末主要起源于網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)向丘腦發(fā)出的上行投射纖維。Houser等已證明網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)向丘腦發(fā)出的上行投射纖維的F終末含γ-氨基丁酸(GABA),故F終末對丘腦VPM向大腦軀體感覺區(qū)投射的神經(jīng)元可能有抑制作用。本研究的結(jié)果表明大鼠PBN神經(jīng)元向丘腦VPM投射,但這些上行投射的軸突終末是屬于哪種類型及含何種神經(jīng)活性物質(zhì)則需要進一步研究。感謝張淼麗和原悅萍同志在圖片制作過程中的幫助。收稿1998-07修回1998-12本文圖1～8見插圖第5頁圖版說明圖1將TMR注入丘腦VPM后,PBN內(nèi)TMR逆標(biāo)神經(jīng)元的分布。KF.KF核PBL.臂旁外側(cè)核PBM.臂旁內(nèi)側(cè)核scp.小腦上腳Vme.三叉神經(jīng)中腦核標(biāo)尺示200μm圖2圖1中a區(qū)的高倍像,示PBL和PBM內(nèi)的TMR逆標(biāo)神經(jīng)元標(biāo)尺示100μm(圖3～5與此相同)圖3圖1中b區(qū)的高倍像,示KF核內(nèi)的TMR逆標(biāo)神經(jīng)元圖4PBL的內(nèi)外側(cè)亞核(IL)內(nèi)的TMR逆標(biāo)神經(jīng)元圖5將HRP注入丘腦VPM后,PBN內(nèi)的HRP逆標(biāo)神經(jīng)元圖6將BDA注入左側(cè)PBN后,BDA順標(biāo)纖維和終末在同側(cè)丘腦VPM和VPL內(nèi)的分布。標(biāo)尺示40μm(圖7,8與此相同)圖7BDA順標(biāo)纖維和終末在對側(cè)丘腦VPM和VPL內(nèi)的分布圖8BDA順標(biāo)纖維和終末在同側(cè)丘腦膠狀質(zhì)核(SM)內(nèi)的分布。mt.乳頭丘腦束ExplanationoffiguresFig.1DistributionofTMRretrogadelylabeledneuronsintheparabrachialnucleus(PBN)afterinjectionTMRintothethalamicventralposteromedialnucleus(VPM).KF,KollikerFusenucleus;BPL,lateralparabrachialnucleus;PBM,medialparabrachialnucleus;scp,superiorcerebellarpeduncle;Vme,trigeminalmesencephalicnucleus.Bar=200μmFig.2TheenlargementofrectangleainFig.1,showingTMRretrogradelylabeledneuronsinthePBLandPBM.Bar=100μmandalsoforFigs.3-5.Fig.3TheenlargementofrectanglebinFig.1,showingTMRretrogradelylabeledneuronsintheKFnucleus.Fig.