結(jié)核分枝桿菌耐左氧氟沙星的基因檢測(cè)

結(jié)核分枝桿菌耐左氧氟沙星的基因檢測(cè)

經(jīng)過(guò)2008年在全國(guó)范圍內(nèi)對(duì)核電站生長(zhǎng)率進(jìn)行的藥物耐藥性調(diào)查的結(jié)果，接近1.3個(gè)結(jié)核病的患者被認(rèn)為是服用抗癲癇藥物的患者，超過(guò)8.32%的患者被認(rèn)為是抗癲癇藥物的患者。喹諾酮類藥物包括左氧氟沙星(LFX)具有良好的抗結(jié)核性能,在耐多藥結(jié)核的治療中起到了重要的作用,但因?yàn)闊o(wú)序及不規(guī)范用藥,已出現(xiàn)了大量對(duì)LFX耐藥的結(jié)核菌株。為避免無(wú)效用藥,臨床迫切需要開(kāi)展LFX的耐藥性檢測(cè)。由于傳統(tǒng)的藥敏檢測(cè)方法需時(shí)較久,遠(yuǎn)不能滿足臨床診治的需求,因此,使用新的、快速的結(jié)核分枝桿菌LFX耐藥性檢測(cè)技術(shù)顯得十分重要。本研究將基因檢測(cè)技術(shù)和顯微鏡觀察藥物敏感性檢測(cè)技術(shù)(MODS)對(duì)MTB的LFX敏感性快速診斷進(jìn)行了研究分析,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。1材料和方法1.1材料表面1.1.1lx耐lx菌株的篩選32株MTB臨床分離株均為本院收治的肺結(jié)核患者痰標(biāo)本分離、篩選出的耐LFX菌株,其中2株單耐LFX,7株為多耐藥,23株為耐多藥;H37Rv為實(shí)驗(yàn)對(duì)照用標(biāo)準(zhǔn)MTB菌株,購(gòu)自國(guó)家菌種保存中心。1.1.2不同溶液配制的藥劑將左氧氟沙星藥粉(揚(yáng)子江藥業(yè))配置成濃度為10mg/mL的藥液后,再將配置好的藥液無(wú)菌濾膜過(guò)濾,分裝,-20℃保存。應(yīng)用時(shí)取出,常溫下溶解,配置成所需濃度。1.1.3培養(yǎng)基PNB鑒別培養(yǎng)基、TCH鑒別培養(yǎng)基、改良羅氏培養(yǎng)基、改良7H9液體培養(yǎng)基均按《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》由本院制備。1.1.4儀器PCR儀(Bio-RAD)、倒置顯微鏡、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板(TPP上海肺科醫(yī)院引進(jìn))。1.2pcr和鑒定痰標(biāo)本MTB的分離、培養(yǎng)與鑒定參照《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》。應(yīng)用改良羅氏培養(yǎng)基法檢測(cè)收集的對(duì)LFX耐藥的MTB臨床分離株32株,其中對(duì)LFX低耐藥21株,對(duì)LFX高耐藥11株。酶及緩沖液、dNTP購(gòu)于TAKARA公司。H37Rv和耐LFX的MTB臨床分離株DNA提取與gyrA目的片段528bp的擴(kuò)增、測(cè)序。采用經(jīng)典的方法提取MTB全染色體DNA作為模板,基因擴(kuò)增在美國(guó)ABI2720themocyclerPCR儀器上進(jìn)行,引物由上海生物工程公司合成,引物序列為P1:5′-GCGCGGCGCAGCTTTATCAC-3′(正向引物)、P2:5′-AGCACCGTCGGCTCTTGCAC-3′(反向引物)。熱循環(huán)為95℃預(yù)變性1min,然后按95℃15s,65℃15s,72℃30s,循環(huán)30個(gè)周期,再72℃延長(zhǎng)7min后,在2%瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物純化和測(cè)序工作由上海華大基因完成,結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)株H37RvgyrA基因相比。MODS檢測(cè)MTB對(duì)LFX耐藥性參照文獻(xiàn)方法,每株待檢菌株檢測(cè)時(shí)設(shè)置兩個(gè)陰性對(duì)照孔,兩個(gè)陽(yáng)性對(duì)照孔,20個(gè)含藥孔。將待檢菌株磨菌后調(diào)整濁度至1個(gè)麥?zhǔn)蠁挝?10-3稀釋,在對(duì)照孔和含藥孔內(nèi)分別加入待檢菌液0.4mL,然后分別加入0.4mLLFX藥液,LFX藥物終濃度選擇實(shí)驗(yàn)分別采用0.0625～12.0μg/mL系列梯度倍比稀釋。將24孔細(xì)胞培養(yǎng)板用膠帶密封,放置密封的塑料袋內(nèi),放入37℃的溫箱培養(yǎng),自孵育后第3天在倒置顯微鏡下開(kāi)始觀察(×400),每天觀察1次,4～7d判斷藥敏結(jié)果,如果對(duì)照孔內(nèi)觀察到索狀結(jié)構(gòu)生長(zhǎng),加藥孔內(nèi)無(wú)索狀結(jié)構(gòu)生長(zhǎng),判定該菌株為敏感株;如加藥孔內(nèi)有索狀結(jié)構(gòu)生長(zhǎng),判定該菌株為耐藥株。每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)H37Rv為質(zhì)控株。2mtb耐藥菌株鑒定2.1H37Rv測(cè)序結(jié)果與H37Rv標(biāo)準(zhǔn)圖譜一致,未見(jiàn)基因突變。32株耐LFX的MTB菌株測(cè)序結(jié)果顯示,32株均有21位密碼子CGA-CCA(Arg-Pro)突變及95位密碼子AGC-ACC(Ser-Thr)突變。對(duì)LFX低耐藥的21株菌株中,3株只有95位密碼子AGC-ACC(Ser-Thr)突變;2株同時(shí)有90位GCG-GTG(Ala-Va1)突變,2株同時(shí)有94位GAC-CAC(Asp-His)突變,5株同時(shí)94位GAC-AAC(Asp-Asn)突變,5株同時(shí)有94位GAC-GGC(Asp-Gly)突變,4株同時(shí)有94位GAC-GCC(Asp-Ala)突變。11株對(duì)LVF高耐藥株中,2株同時(shí)有90位GCG-GTG(Ala-Val)突變,3株同時(shí)有94位GAC-GGC(Asp-Gly)突變,2株同時(shí)有94位GAC-GCC(Asp-Ala)突變,2株同時(shí)有94位GAC-TAC(Asp-Tyr)突變,1株同時(shí)有91位TCG-CCG(Ser-Pro)突變。除外21位密碼子CGA-CCA突變及95位密碼子AGC-ACC突變考慮為正常突變,均未發(fā)現(xiàn)雙突變,見(jiàn)表1。2.2MODS技術(shù)檢測(cè)結(jié)果并與羅氏絕對(duì)濃度法結(jié)果進(jìn)行比較,采用MODS技術(shù)檢測(cè)32株MTB菌株LFX耐藥性,其中30株在7d內(nèi)均獲得藥敏結(jié)果,而羅氏藥敏4～6周才能判定結(jié)果。細(xì)胞培養(yǎng)板改良7H9液體培養(yǎng)基條件下LFX的MIC為0.25μg/mL,低耐藥設(shè)定值大于1.0μg/mL,高耐藥設(shè)定值大于4.0μg/mL,兩法藥敏結(jié)果相符31株,符合率96.9%(31/32)。不符合的1株為羅氏絕對(duì)濃度法低耐藥,而MODS技術(shù)檢測(cè)判定為敏感。3基因檢測(cè)結(jié)果由于LFX具有良好的抗結(jié)核菌活性,目前被世界衛(wèi)生組織推薦作為主要的抗結(jié)核藥物在耐藥和耐多藥結(jié)核病患者中使用。眾所周知,LFX被作為高效廣譜抗菌劑已廣泛應(yīng)用于臨床多年,甚至到了濫用的程度。隨著LFX的無(wú)序及不規(guī)范使用,其對(duì)MTB的耐藥性也逐漸顯現(xiàn)出來(lái),有資料統(tǒng)計(jì)耐多藥菌株中LFX耐藥率超過(guò)一半以上,這種現(xiàn)狀下,如何盡早獲知結(jié)核菌株對(duì)LFX耐藥的重要性和必要性不言而喻。本文選擇已獲得羅氏培養(yǎng)藥敏鑒定的耐LFX的MTB菌株作為檢測(cè)對(duì)象,利用基因檢測(cè)方法和顯微鏡觀察藥物敏感性檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行了快速檢測(cè),并就檢測(cè)結(jié)果、方法學(xué)的優(yōu)劣及作為適宜技術(shù)推廣價(jià)值進(jìn)行簡(jiǎn)單分析?；驒z測(cè)的依據(jù)是LFX主要通過(guò)抑制DNA旋轉(zhuǎn)酶A(gyraseA)亞單位與DNA的結(jié)合,從而抑制結(jié)核菌DNA的復(fù)制與表達(dá),達(dá)到對(duì)MTB的殺滅作用。gyrA是DNA旋轉(zhuǎn)酶A亞單位的編碼基因,它的突變導(dǎo)致LFX無(wú)法與DNA旋轉(zhuǎn)酶A亞單位結(jié)合,使MTB對(duì)LFX產(chǎn)生耐藥?；驒z測(cè)結(jié)果提示,H37Rv未發(fā)生gyrA基因突變,與H37Rv株序列的差異比較顯示,32株耐LFX臨床株21位密碼子CGA-CCA及95位密碼子AGC-ACC均發(fā)生突變,考慮為正常突變。29株耐LFX臨床株發(fā)生了有義突變,分別在第90、91和94位密碼子上,突變率為90.6%,未發(fā)現(xiàn)在同一株MTB上存在gyrA雙突變的情況。從突變點(diǎn)位及核酸突變模式看,未能發(fā)現(xiàn)低耐藥株和高耐藥株有明顯差異,因此不能從基因突變檢測(cè)方法來(lái)完全區(qū)別低耐藥和高耐藥。本實(shí)驗(yàn)中有3株LFX耐藥株未發(fā)現(xiàn)gyrA突變,提示gyrA突變不是MTB耐氟喹諾酮類藥物惟一的機(jī)制,可能是gyrB突變、細(xì)菌對(duì)喹諾酮類通透性降低、細(xì)菌對(duì)藥物主動(dòng)外排增強(qiáng)等,本文未進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。MODS的依據(jù)是MTB在液體培養(yǎng)基中快速生長(zhǎng)會(huì)有特征性索狀結(jié)構(gòu)的形成,該結(jié)構(gòu)較容易在顯微鏡下被觀察到。MODS技術(shù)是近幾年研究較多的一種快速診斷MTB耐藥性表型的新方法,已被證明檢測(cè)快速、成本低廉、敏感性及特異性和常規(guī)藥物敏感實(shí)驗(yàn)高度一致、重復(fù)性好。本實(shí)驗(yàn)利用MODS技術(shù)檢測(cè)32株MTB菌株LFX耐藥性,其中30株在7d內(nèi)均獲得藥敏結(jié)果,和羅氏藥敏結(jié)果比較,時(shí)間上明顯縮短。兩種方法藥敏結(jié)果相符31株,符合率極高(96.9%),且低耐藥及高耐藥檢測(cè)結(jié)果也與羅氏藥敏結(jié)果高度一致。從方法學(xué)角度看,基因檢測(cè)及MODS技術(shù)對(duì)MTB菌株LFX耐藥性診斷都能達(dá)到快速檢測(cè)要求,且與羅氏藥敏結(jié)果符合率也較高。但就本實(shí)驗(yàn)提供MTB菌株基因檢測(cè)結(jié)果看,MTB菌株LFX耐藥性還不能完全用基因突變解釋,也不能從基因突變檢測(cè)方法來(lái)完全區(qū)別低耐藥和高耐藥,且基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)要求高,專用設(shè)備不是一般實(shí)驗(yàn)室能具備的,批量檢測(cè)成本較低而單個(gè)檢測(cè)比較麻煩。MODS技術(shù)檢測(cè)MTB菌株LFX耐藥性,與羅氏藥敏結(jié)果高度一致,在時(shí)間、檢測(cè)成本方面占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì),能在基層實(shí)驗(yàn)室推廣應(yīng)用?？焖佟?zhǔn)確檢測(cè)到對(duì)LFX低耐藥MTB菌株,有利于及時(shí)更換有效的抗結(jié)核藥物,