大鼠腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)、關(guān)系及分布

大鼠腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)、關(guān)系及分布

根據(jù)文獻(xiàn)，不同的刺激，包括生理和病理刺激，都能誘導(dǎo)大鼠大腦c-fos的出現(xiàn)。c-fos及其轉(zhuǎn)移產(chǎn)物的出現(xiàn)表明腦血管激活，因此通常被用作神經(jīng)功能研究的手段。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為,星形膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)系統(tǒng)中主要起著支持、營(yíng)養(yǎng)的作用。然而隨著認(rèn)識(shí)的不斷深入,膠質(zhì)細(xì)胞的功能日益受到人們的重視。已證實(shí):星形膠質(zhì)細(xì)胞可接受神經(jīng)元傳來的信息,并以鈣波的形式在膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)部傳遞,最終還可通過釋放的谷氨酸反饋于神經(jīng)元影響其功能,從而說明星形膠質(zhì)細(xì)胞參與了神經(jīng)信息的中樞整合。以往的應(yīng)激模型多用于觀察神經(jīng)元的反應(yīng)性變化,本研究則試圖從神經(jīng)元與膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)的角度觀察神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)生理性刺激(飲用3%NaCl,2d和5d)的反應(yīng),探討神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞—神經(jīng)元通訊在維持腦功能中的作用。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的分組用SD成年雄性大鼠12只,體重180~230g,(本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)置于溫暖(20℃)安靜的環(huán)境飼養(yǎng)48h,隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(n=8)和對(duì)照組(n=4)。1.試驗(yàn)組1.1經(jīng)皮穿刺加熱給予大鼠3%的氯化鈉溶液替代正常淡水,分別飼養(yǎng)2d和5d后,用1%戊巴比妥鈉(40mg/kg,i.p.)麻醉,迅速開胸經(jīng)升主動(dòng)脈插管,先以100ml生理鹽水沖洗血液,隨后用4℃的含4%多聚甲醛的0.1mol/L磷酸緩沖液(PB,pH7.4)先快后慢灌流固定。1.5h后取腦置于20%蔗糖中(4℃)直至組織沉底。用冰凍切片機(jī)切制大腦連續(xù)冠狀切片,片厚30μm,每6張取1張,切片收集于0.01mol/L的PBS中。1.2抗fos藥物反應(yīng)切片經(jīng)0.01mol/LPBS漂洗后,入含0.3%TritonX-100的PBS中浸泡30min(室溫)后依次入:(1)兔抗FOS抗體稀釋液(1∶3000,SantaCruz),室溫孵育24h;(2)生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶500,Sigma)室溫孵育2~4h;(3)生物素-卵白素-HRP復(fù)合物(ABC1∶500,Sigma)中室溫孵育2~4h。然后用葡萄糖氧化酶-DAB-硫酸鎳銨法加強(qiáng)。以上每一步驟之后均用PBS液充分漂洗3次,每次10min(下同)。顯色后,切片繼續(xù)用ABC進(jìn)行抗膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)反應(yīng)。除用抗GFAP抗體稀釋液(1∶3000,DAKO)替代抗FOS抗體稀釋液外,其余步驟均與FOS反應(yīng)相同。雙標(biāo)后的切片再進(jìn)行抗酪氨酸羥化酶(TH)或加壓素(VP)的第三次免疫組織化學(xué)反應(yīng),步驟如下:(1)切片在小鼠抗TH單克隆抗體稀釋液(1∶5000,Calblochem)或兔抗VP多克隆抗體稀釋液(1∶2000,Watpa)中室溫孵育24h;(2)生物素標(biāo)記的驢抗小鼠或羊抗兔IgG(1∶500,Sigma)中室溫孵育2~4h;(3)ABC復(fù)合物中室溫孵育2~4h。(4)DAB-H2O2溶液中進(jìn)行棕色反應(yīng)。結(jié)束三次染色的切片經(jīng)漂洗后裱片、晾干、脫水、透明,封固后在光鏡下觀察并照相?？笷OS、抗GFAP單標(biāo)和FOS/GFAP雙標(biāo)的程序?yàn)樯鲜龀绦虻囊徊糠帧?.對(duì)照組和對(duì)照組測(cè)試組2.1正常對(duì)照組大鼠給予正常淡水,在同樣的環(huán)境下存活2d和5d之后在深麻下按實(shí)驗(yàn)組方法對(duì)動(dòng)物灌流固定、切片和免疫組織化學(xué)染色。2.2比較實(shí)驗(yàn)大鼠給予0.9%的生理鹽水,其它步驟同上,結(jié)果與正常對(duì)照組相同。2.3免疫組化反應(yīng)取實(shí)驗(yàn)組腦切片,用0.01mol/LPBS分別替代抗FOS、抗GFAP以及抗TH抗體,按ABC法進(jìn)行免疫組化反應(yīng),結(jié)果為陰性。結(jié)果1.gfp陽(yáng)性細(xì)胞分布1.1gfap陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)的部位除延髓內(nèi)臟帶(MVZ)的孤束核(NTS)、臂旁核(PB)、藍(lán)斑(LC)(上述部位均與基本生命活動(dòng)的調(diào)節(jié)有關(guān))外,其它部位未發(fā)現(xiàn)有意義的GFAP陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)。GFAP陽(yáng)性細(xì)胞的胞體小,突起細(xì),散在分布。1.2gfap陽(yáng)性細(xì)胞在MVZ、PB和LC(Fig.3)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞較對(duì)照組明顯增多,在MVZ主要分布于NTS的內(nèi)側(cè)部(Fig.1)和帶中間部的內(nèi)側(cè)半,在MVZ的腹外側(cè)區(qū)(VLM)GFAP陽(yáng)性反應(yīng)較少,胞體少,突起細(xì)短,染色淺;在最后區(qū)(AP)和血管周圍、靠近軟膜處,GFAP陽(yáng)性細(xì)胞的突起較多并且大多指向AP。AP內(nèi)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞緊密包裹血管。味覺核(GU)(Fig.2)、中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)腹外側(cè)區(qū)(VIPAG)、上丘中灰層(InG)(Fig.4)也出現(xiàn)一定數(shù)量的GFAP陽(yáng)性細(xì)胞。下丘腦室旁核外側(cè)大細(xì)胞部(PaLM)(Fig.5)和腹側(cè)部(PaV)(Fig.6)、下丘腦乳頭體上核(SUM)、視上核(SON)(Fig.7)和穹隆下器(SFO)(Fig.8)等有較密集的GFAP出現(xiàn)。高倍視野下觀察,胞體肥大,深染,纖維粗長(zhǎng)。海馬齒狀回、杏仁核、大腦皮層Ⅱ、Ⅳ、Ⅵ層也有一定程度的GFAP表達(dá)。皮層Ⅱ、Ⅳ層GFAP陽(yáng)性細(xì)胞突起粗長(zhǎng),Ⅵ層胞體較小突起短,其它部位僅有散在分布。飲用高滲鹽水5d者GFAP陽(yáng)性細(xì)胞在數(shù)量上比2d者明顯增多。2.fos陽(yáng)性細(xì)胞分布2.1對(duì)照組除MVZ、PB、LC等有少量FOS陽(yáng)性胞核外,其他腦區(qū)未見明顯的FOS陽(yáng)性表達(dá)。2.2中間帶內(nèi)半fos表達(dá)MVZ、PB、LC(Fig.3)等處的FOS陽(yáng)性胞體明顯增加,在MVZ主要集中分布于NTS內(nèi)側(cè)區(qū)(Fig.1)和中間帶的內(nèi)側(cè)半,VLM較稀少,GU有密集的FOS表達(dá)(Fig.2),在中腦InG(Fig.4)、VIPAG;PaLM和PaV(Figs.5,6)、SON(Fig.7),弓狀核(Arc)和SUM以及SFO(Fig.8)均有較多的FOS表達(dá),以SON、PaLM和PaV最密集。3.fos-li+/th-li+/gfap-li+復(fù)合材料的結(jié)構(gòu)在三重反應(yīng)的腦片上觀察到以下幾種結(jié)構(gòu)。(1)三標(biāo)記復(fù)合體,有FOS-LI+/TH-LI+/GFAP-LI+和FOS-LI+/VP-LI+/GFAP-LI+。神經(jīng)元胞核呈藍(lán)黑色,胞漿為棕黃色,GFAP-LI細(xì)胞的胞體、突起為黑色并與神經(jīng)元接觸。FOS-LI+/TH-LI+/GFAP-LI+復(fù)合體主要分布于NTS(Fig.1);FOS-LI+/VP-LI+/GFAP-LI+復(fù)合體主要分布于SON(Fig.7)、PaV和SFO。(2)二標(biāo)記復(fù)合體,有FOS-LI陰性(-)/TH-LI+/GFAP-LI+復(fù)合體和FOS-LI-/VP-LI+/GFAP-LI+復(fù)合體二種,其特點(diǎn)是TH或VP陽(yáng)性神經(jīng)元(胞漿棕藍(lán)色)與GFAP陽(yáng)性的星形膠質(zhì)細(xì)胞接觸,但神經(jīng)元胞核FOS為陰性(Figs.1,6,7)。分布部位與三標(biāo)記復(fù)合體相同。(3)二標(biāo)記復(fù)合體FOS-LI+/GFAP-LI+復(fù)合體,在FOS陽(yáng)性胞核周圍有GFAP陽(yáng)性產(chǎn)物包繞。在PB,VIPAG,InG,SUM等部位,主要是GFAP-LI+/FOS-LI+復(fù)合體。星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性可能GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞的骨架蛋白,構(gòu)成中間絲,是星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)記物。用原位雜交方法可顯示GFAP的mRNA,用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)可顯示GFAP蛋白。研究發(fā)現(xiàn)正常大鼠腦內(nèi)(主要是灰質(zhì))許多星形膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)為GFAP免疫組化反應(yīng)陰性。這一點(diǎn)從本文正常對(duì)照組的結(jié)果也可得到證實(shí)。研究證明,星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)刺激(傷害性或病理性)起反應(yīng),其標(biāo)志之一是GFAP的表達(dá)上調(diào),因此目前又將GFAP的表達(dá)作為星形膠質(zhì)細(xì)胞活動(dòng)狀態(tài)的標(biāo)志之一而被廣泛使用。傳統(tǒng)認(rèn)為膠質(zhì)細(xì)胞的功能是對(duì)神經(jīng)元支持、營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)。近20多年來對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)與機(jī)能的研究也取得了較大的進(jìn)展,特別是發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元存在直接的往返的相互作用,并在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的信息處理中起著重要的作用。本文提出在大鼠腦內(nèi)原位觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)滲透壓改變的反應(yīng)及與神經(jīng)元之間關(guān)系的研究思路。采用抗GFAP(顯示星形膠質(zhì)細(xì)胞)與抗FOS蛋白和抗TH或VP等(顯示神經(jīng)元)相結(jié)合的免疫組化多重標(biāo)記技術(shù),以期在同一切片上顯示神經(jīng)元功能狀態(tài)及神經(jīng)活性物質(zhì)的同時(shí)也顯示星形膠質(zhì)細(xì)胞活性狀態(tài)。為從形態(tài)學(xué)上探討神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)刺激的反應(yīng)及其相互關(guān)系提供了有用的技術(shù)。本文的結(jié)果證實(shí)了以下二點(diǎn):1.SON是滲透壓調(diào)節(jié)的關(guān)鍵核團(tuán),已證明高滲狀態(tài)下SON神經(jīng)元被激活,FOS、JUN蛋白表達(dá)增強(qiáng),并且存在時(shí)空效應(yīng),有些活性神經(jīng)元的遞質(zhì)為兒茶酚胺類。作者的研究結(jié)果表明,不僅在與滲透壓調(diào)節(jié)關(guān)系密切的PaLM、PaV和SONFOS-LI的分布與GFAP-LI星形膠質(zhì)細(xì)胞的分布有明顯的一致,在MVZ、室周器官及皮層等腦區(qū)及核團(tuán)內(nèi)兩者之間亦有相伴關(guān)系。本研究還觀察到NTS內(nèi)GFAP-LI細(xì)胞的突起具有一定的趨向性,向AP方向延伸,排列整齊。值得一提的是在MVZ反應(yīng)主要在NTS的內(nèi)側(cè)部,而VLM的反應(yīng)弱,FOS稀少,與在血壓變化實(shí)驗(yàn)中的結(jié)果不同(待發(fā)表),說明VLM與滲透壓的調(diào)節(jié)關(guān)系較小。本文認(rèn)為動(dòng)物飲用鹽水后,血液和腦脊液滲透壓的變化首先激活了室周器官和近腦脊液處的星形膠質(zhì)細(xì)胞,然后通過其與神經(jīng)元之間的相互作用,將信息傳給神經(jīng)元。2.本文通過三重標(biāo)記法,清晰地顯示出在腦內(nèi)對(duì)滲透壓變化起反應(yīng)的區(qū)域,被激活的神經(jīng)元(FOS-LI)和星形膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP-LI)的形態(tài)及其相互關(guān)系。發(fā)現(xiàn)二者關(guān)系密切形成一個(gè)復(fù)合體樣的結(jié)構(gòu),一個(gè)復(fù)合體包括一個(gè)神經(jīng)元與若干星形膠質(zhì)細(xì)胞,擬命名為神經(jīng)元—星形膠質(zhì)細(xì)胞復(fù)合體(Neuronal-AstrocyticComplex)。在反應(yīng)區(qū)內(nèi)未發(fā)現(xiàn)非復(fù)合體的形式的FOS-LI神經(jīng)元或GFAP-LI細(xì)胞;在非反應(yīng)區(qū)則未發(fā)現(xiàn)FOS-LI+/GFAP-LI+的復(fù)合體。作者通過雙重免疫電鏡技術(shù)證實(shí)星形膠質(zhì)細(xì)胞的突起與神經(jīng)元胞體,樹突或軸突發(fā)生接觸,有的部位二者胞膜的電子密度增加,膜增厚,可能是活性點(diǎn)。有意義的是滲透壓變化時(shí),在SON和NTS內(nèi)這種活性點(diǎn)明顯地增加(待發(fā)表)。因此作者認(rèn)為這種復(fù)合體可能是中樞神經(jīng)的功能單位。關(guān)于神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細(xì)胞之間的密切關(guān)系,Grosche等在小腦Bergmannglialcell突起上發(fā)現(xiàn)了與神經(jīng)元密切接觸的“microdomains”,并認(rèn)為它可能參與神經(jīng)元與膠質(zhì)細(xì)胞之間信息交流,從結(jié)構(gòu)上支持了此復(fù)合體的存在。Alvarez-Mauebecin等證實(shí)藍(lán)斑核內(nèi)的星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元存在同步膜