馬來酸氟吡汀緩釋片在beagle犬體內(nèi)的藥動學(xué)和生物等效性研究

馬來酸氟吡汀緩釋片在beagle犬體內(nèi)的藥動學(xué)和生物等效性研究

馬來酸氟吡啶是一種新型的非阿片類抗疼痛藥物。這個名字叫干預(yù)。它是一種選擇性的神經(jīng)退行劑。具有止痛、肌肉松弛和神經(jīng)保護的雙重療效。沒有耐藥性和依賴，任何作用都可以發(fā)揮劑量依賴性。臨床主要用于各種類型的中等程度的急性疼痛的治療,如外科手術(shù)、創(chuàng)傷等引起的疼痛以及頭痛、偏頭痛及腹部痙攣等。本藥口服吸收迅速,半衰期較短,體內(nèi)消除快,為降低血藥濃度峰谷效應(yīng),減少給藥次數(shù),德國AWD公司研發(fā)生產(chǎn)了馬來酸氟吡汀緩釋片(商品名:katadolon?Slong,規(guī)格為400mg·片-1)。本試驗對四川百利藥業(yè)公司研制的馬來酸氟吡汀緩釋片進行Beagle犬體內(nèi)藥動學(xué)研究,并以德國AWD公司生產(chǎn)的馬來酸氟吡汀緩釋片為參比制劑進行生物等效性研究,國內(nèi)外有多篇有關(guān)馬來酸氟吡汀藥動學(xué)報道,但關(guān)于其緩釋片藥動學(xué)的文獻未見報道。1藥品、試劑與儀器島津LC-20A高效液相色譜儀(日本島津);WatersTM474熒光檢測器(美國Waters);氮吹儀(上海泉島科貿(mào)有限公司);混懸儀(德國IKA);離心機(上海市安亭科技儀器廠);電子天平(德國Sartorius)。參比制劑馬來酸氟吡汀緩釋片(R,400mg·片-1,批號PZN-0237831,德國AWD公司),受試制劑馬來酸氟吡汀緩釋片(T,400mg·片-1,批號110813,四川百利藥業(yè)有限責任公司);馬來酸氟吡汀對照品(純度,99.8%,批號090902,四川百利藥業(yè)有限責任公司),替米沙坦對照品(內(nèi)標,純度99.7%,批號110501,南通宏慈藥業(yè)有限公司);二氯甲烷(分析純,天津市富宇精細化工有限公司);乙腈(色譜純,sigma,美國),甲醇(色譜純,上海陸都化學(xué)試劑廠),水為去離子水。試驗動物:Beagle犬6只,雌雄各半,年齡(1.0±0.2)歲,體重8～10kg,試驗前未服用過其他藥物。2醇溶液配制成濃度取馬來酸氟吡汀對照品15mg,精密稱定,置50mL量瓶中,用甲醇溶解定容,配制成濃度為300μg·mL-1儲備液。取不同體積的儲備液用甲醇稀釋為濃度為0.60,1.20,12.00,30.00,60.00,120.00,150.00μg·mL-1標準曲線工作液。3單次給藥后統(tǒng)一6條健康成年Beagle犬,雌雄各半,隨機分成2組,采用隨機雙交叉自身對照試驗,清洗期為1周,實驗前1d禁食12h,給藥4h后統(tǒng)一進食。將受試制劑或參比制劑按1片·只-1,直接塞入舌根部,使犬自動吞咽,分別于給藥前及給藥后0.25,0.5,0.75,1,1.5,2,3,4,6,8,12,24,36,48h于前肢靜脈取血3mL,置肝素化的真空管中,3000r·min-1離心15min,分離血漿后-20℃低溫保存待測。4血樣的前置管和給藥單劑量試驗完成后,此6只犬經(jīng)過2周清洗期后用于多劑量給藥試驗。隨機分成2組,采用隨機雙周期交叉自身對照試驗,清洗期為1周。按1片·d-1、1片·只-1,連續(xù)給藥7d,前6d正常進食,第7d給藥前禁食12h,給藥后4h進食,給藥方法同前,第5d～7d晨服藥前抽取血樣于第7d早晨服藥后0.50,0.75,1,1.5,2,3,4,5,6,8,12,24,36,48h于下肢靜脈取血3mL置于肝素化的真空離心管中,3000r·min-1離心15min,分離血漿置-20℃低溫保存待測,間隔一周后,兩組交叉服藥。5萃取劑為5.5%氨甲基-1-甲基苯磺酸酯2-氯甲基取室溫下融化的血漿0.5mL于5mLEP管中,分別加入甲醇、內(nèi)標溶液各50μL,渦旋30s,加入10%氨水50μL和萃取劑(二氯甲烷)3.5mL,渦旋4min,12000r·min-1離心5min。棄掉上層,吸取下層有機相于40℃空氣吹干,殘渣用0.5mL流動相復(fù)溶,混懸1min,12000r·min-1離心3min,取上清液10μL進樣。6方法和結(jié)果6.1柱溫度和溫度色譜柱:DiamonsilC18(5μm,250mm×4.6mm);流動相:,0.005mol·L-1磷酸氫二鈉緩沖液(pH=6.7)-甲醇-乙腈(42∶14.5∶43.5);柱溫:30℃;流速:1mL·min-1;檢測波長:激發(fā)波長:320nm;發(fā)射波長:370nm;進樣量:10μL。6.2汀、空白血漿+內(nèi)標+馬來酸氟吡汀對照品甲醇溶液色譜圖在上述色譜條件下,測定的空白血漿、空白血將+內(nèi)標、空白血漿+馬來酸氟吡汀、空白血漿+內(nèi)標+馬來酸氟吡汀、樣品、馬來酸氟吡汀對照品甲醇溶液色譜圖見圖1。其中,內(nèi)源性物質(zhì)不干擾馬來酸氟吡汀和內(nèi)標的測定。在此色譜條件下馬來酸氟吡汀、替米沙坦的保留時間分別為6.4min,4.7min。6.3內(nèi)標溶液的配制取室溫融化下的空白血漿0.5mL,置5mLEP管中,分別加入馬來酸氟吡汀標準曲線系列工作液50μL,配制成濃度分別為0.06,0.12,0.30,1.20,3.00,6.00,12.00,15.00μg·mL-1的馬來酸氟吡汀標準血漿樣品,加入內(nèi)標溶液50μL(取替苯沙坦對照品12mg,精密稱定,置于25mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度。取該溶液適量用甲醇稀釋得濃度為3.827μg·mL-1的內(nèi)標溶液。),依照“5”項下方法“渦旋30s…”開始操作,進樣測定以濃度為橫坐標,以馬來酸氟吡汀與內(nèi)標面積的比值為縱坐標,繪制標準曲線,按照加權(quán)最小二乘法計算線性關(guān)系式為:Y=7.35×10-4X-31.64×10-4r=0.9984線性范圍為0.06～15.00μg·mL-1。6.4方法回收率照“6.3”項下方法配制濃度為12.00,1.20,0.12,0.06μg·mL-1的標準血漿樣品,按“5”項下方法操作,進行精密度和方法回收率試驗;結(jié)果測得批內(nèi)RSD(n=5)分別為2.4%,4.6%,1.9%,3.7%;批間RSD(n=15)分別為6.2%,7.0%,3.7%,3.5%。高、中、低、極低濃度血漿樣品的方法回收率(n=5)分別為101.4%,98.7%,95.8%,103.8%;與高、中、低相同濃度對照品和內(nèi)標未經(jīng)萃取獲得的峰面積相比,得高、中、低樣品萃取回收率(n=3)分別為:85.1%,82.9%,84.1%;內(nèi)標萃取回收率為:65.4%。6.5品-20c穩(wěn)定性考察了高、中、低3個濃度含藥血漿樣品-20°C保存22d、反復(fù)凍融3次、處理后自動進樣器放置25h以及室溫放置7h的穩(wěn)定性,結(jié)果見表1。7內(nèi)針采血與狗體內(nèi)7.1藥動學(xué)參數(shù)評價口服給藥后,Cmax,Tmax均由實驗數(shù)據(jù)直接讀出;AUC0-t、AUC0-∞等藥物動力學(xué)參數(shù)由藥動學(xué)軟件DAS2.0計算。并采用DAS2.0軟件和SPSS13.0統(tǒng)計評價受試制劑和參比制劑的生物等效性;Cav(平均穩(wěn)態(tài)血藥濃度)公式如下:Cav=AUC?ss/τCav=AUC?ss/τ;血藥濃度波動度DF(%)=[(Cssmaxmaxss-Cssminminss)/Cav]×100%;相對生物利用度F=AUC受試制劑/AUC參比制劑×100%。對以上主要藥動學(xué)參數(shù)采用配對t檢驗進行統(tǒng)計分析;對Cmax,AUC0～τ,AUC0～∞經(jīng)自然對數(shù)轉(zhuǎn)換后作方差分析;雙單側(cè)t檢驗和置信區(qū)間估計進行生物等效性評價。參數(shù)tmax采用非參數(shù)法(Wilcoxon符號秩和檢驗)進行統(tǒng)計;若受試制劑AUC的90%可信限落在參比制劑的80%～125%范圍內(nèi),受試制劑Cmax的90%可信限落在參比制劑的80%～125%范圍內(nèi),tmax經(jīng)非參數(shù)檢驗無顯著性差異,則可以認定受試制劑與參比制劑生物等效。7.2血藥濃度測定(1)單劑量給藥試驗:6只健康Beagle犬單劑量口服馬來酸氟吡汀緩釋片受試制劑或參比制劑1片,用高效液相色譜法測得各時間段血藥濃度數(shù)據(jù),平均藥-時曲線見圖2-A。(2)多劑量給藥試驗:6只健康Beagle犬單劑量口服馬來酸氟吡汀緩釋片受試制劑或參比制劑,1片·d-1,連續(xù)服藥7d,測得給藥后第5,6,7d清晨服藥前血藥濃度數(shù)據(jù)及末次給藥后的血藥濃度數(shù)據(jù),平均藥-時曲線見圖2-B。7.3醫(yī)學(xué)參數(shù)Beagle犬口服2種馬來酸氟吡汀緩釋片的藥動學(xué)參數(shù)見表2。7.4相對生物利用度將單劑量及多劑量給藥試驗的主要藥動學(xué)參數(shù)經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后進行方差分析。結(jié)果顯示,2種試驗中受試制劑與參比制劑間藥動學(xué)各參數(shù)間均無顯著性差異(P>0.05)。單劑量給藥受試制劑與參比制劑比較時的相對生物利用度為(98.30±16.90)%。多劑量給藥受試制劑與參比給藥試驗用穩(wěn)態(tài)藥-時曲線下面積(AUCss)計算多劑量口服受試制劑與參比制劑達穩(wěn)態(tài)時相對生物利用度為(115.00±16.50)%。上述結(jié)果表明,單劑量及多劑量給藥情況下,兩制劑吸收程度及吸收速度具有生物等效性。8生物等效性試驗本研究參考相關(guān)文獻建立了檢測Beagle犬血漿中馬來酸氟吡汀的色譜方法,對于流動相的選擇,有機相單選甲醇或乙腈均柱效較低,將二者按照3∶1比例混合可提高柱效,改善峰形。本研究選擇替米沙坦作為內(nèi)標,據(jù)文獻報道,替米沙坦的脂溶性強,激發(fā)波長305nm,發(fā)射波長365nm.,能在本文的色譜條件下檢測到,且峰形較好。根據(jù)文獻報道馬來酸氟吡汀在體內(nèi)可產(chǎn)生2種代謝產(chǎn)物,在本研究中可測到血漿中1種代謝產(chǎn)物,根據(jù)峰面積判斷,此代謝物血藥濃度變化趨勢和氟吡汀相似,但本研究沒有對此代謝物進行定量測定,其原因:1)文獻報道的2種代謝物的對照品均不易獲得;2)SFDA在技術(shù)指南中對生物等效的評價的定義為:藥學(xué)等效制劑或可替換藥物在相同的試驗條件下,服用相同的劑量,其活性成分吸收程度和速度的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。馬來酸氟吡汀在體內(nèi)主要以原藥形式發(fā)揮作用,它的代謝產(chǎn)物M1(2-氨基-3-乙酰氨-6-(4-氟)-苯甲氨基吡啶)的鎮(zhèn)痛活性為馬來酸氟吡汀的20%～30%,而另一個代謝產(chǎn)物M2則無生物活性;3)FDA也首先推薦的是進行來自藥物制劑中母體藥物的測量,這是因為母體藥物的濃度-時間曲線對于藥物制劑質(zhì)量的變化比代謝物更為敏感;4)馬來酸氟吡汀在體內(nèi)主要以原藥形式存在,從代謝物的峰面積推測,代謝物的產(chǎn)生量很少。在單劑量試驗中,共設(shè)計15個取樣點,