應(yīng)激大鼠腦邊緣系統(tǒng)內(nèi)一氧化氮合酶陽性神經(jīng)元的分布

應(yīng)激大鼠腦邊緣系統(tǒng)內(nèi)一氧化氮合酶陽性神經(jīng)元的分布

由于生境的快速變化和棲息地脆弱性，以往的文獻(xiàn)主要集中在動物行為的觀察上（江燕等人，2000；邵鄰平等，2002），但對動物腦中神經(jīng)元變化的報道很少。腦邊緣系統(tǒng)與動物的嗅覺和內(nèi)臟活動有密切關(guān)系,并參與個體生存和種族繁衍功能(如覓食、防御、攻擊、情緒反應(yīng)和生殖行為等),海馬還與高級神經(jīng)活動記憶有關(guān)(于頻,1996)。本研究利用動物食物鏈的捕食關(guān)系,建立恐懼應(yīng)激模型,采用NADPH-d酶組織化學(xué)方法觀察實驗動物腦邊緣系統(tǒng)皮質(zhì)、海馬、紋狀體和下丘腦NOS陽性神經(jīng)元的變化,探討劣性應(yīng)激對腦內(nèi)神經(jīng)元的影響并提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。1材料和方法1.1實驗動物及動物選用雄性Sprague-Dawley大鼠(南京湯山青龍山實驗動物中心提供),體重220-250g。自由飲食,20-30℃條件下飼養(yǎng)。1.2實驗?zāi)Ｐ偷闹苽鋵?0只雄性SD大鼠隨機(jī)分為單純捕食應(yīng)激組(n=30)、加強(qiáng)捕食應(yīng)激組(n=30)和對照組(n=20)。捕食應(yīng)激實驗箱為1m×1m×1m鐵絲籠,中間固定一個20cm×20cm×20cm的小鐵絲籠,以便在實驗中將鼠放入其中,籠中設(shè)一蜂鳴器。先將鼠放入捕食應(yīng)激實驗箱的小籠中,在蜂鳴器鳴叫的同時將一只饑餓的貓放入實驗箱中。模型制備參照王慶松和張建華(2001)的方法并加以改進(jìn):單純組鼠與貓無生理傷害接觸10min/d;加強(qiáng)組鼠與貓無生理傷害接觸10min/d后4h,被再次置于實驗環(huán)境中靜置10min,但蜂鳴后不再放入貓;對照組鼠除不接觸貓外,其它處理程序相同。1.3灌注0.9%鹽水、多聚甲醛,添加20%蔗糖溶液各組動物分別于應(yīng)激1、3、6、12、21、30d的第2d上午進(jìn)行。10%水合氯醛(40mg/kg)腹腔麻醉,經(jīng)左心室依次灌注0.9%生理鹽水(200ml左右),4%多聚甲醛(0.1molPB,pH7.2)250ml;取腦,4℃后固定4-48h,再置于20%蔗糖溶液(0.1molPB,pH7.2)4℃過夜;冰凍切片,片厚40μm,收集于0.1mol/LTris-HClbuffer(pH7.6)中備用。1.4癟c-l-4-氣調(diào)包裝主要試劑:NADPH-d購自Sigma公司,其余試劑均為國產(chǎn)。染色方法參照Heatheretal.(1997)。經(jīng)Tris-HClbuffer漂洗5min×3次,入孵育液37℃水浴1-2h。孵育液的組成:由0.1mol/LTris-HClbuffer(pH7.6)配制,內(nèi)含0.25mg/mlNBT,1mg/mlβ-NADPH,0.2%Tritonx-100。然后用0.1mol/LTris-HClbuffer終止反應(yīng)并充分漂洗,APES玻片裱片,室溫中干燥;脫水、透明和封片。對照液:無NADPH的孵育液。1.5nos活性測試1.5.1nos陽性神經(jīng)元按大鼠腦立體定位圖譜(包新民、舒斯云,1991),在光鏡下觀察皮質(zhì)、紋狀體(選其尾殼核)、下丘腦、海馬CA3區(qū)等部位NOS陽性神經(jīng)元。經(jīng)NADPH-d酶組織化學(xué)法染色后,腦內(nèi)NOS陽性神經(jīng)元及其纖維呈藍(lán)色,陽性物質(zhì)積聚于胞漿和突起內(nèi);毛細(xì)血管也染成淺藍(lán)色。陽性神經(jīng)元可分為強(qiáng)陽性、中等和弱陽性三種類型。強(qiáng)陽性NOS神經(jīng)元染成深藍(lán)色,弱陽性NOS神經(jīng)元著色較淡,中等強(qiáng)度介于二者之間。1.5.2nos陽性細(xì)胞數(shù)和均數(shù)的統(tǒng)計統(tǒng)計方法參照劉輝等(劉輝等,2000),每只大鼠取2張切片,在光鏡下分別隨機(jī)選皮質(zhì)、紋狀體尾殼核、海馬CA3區(qū)、下丘腦室旁核和室周核各3個視野(10×40);統(tǒng)計NOS陽性細(xì)胞數(shù),算出每個視野的均數(shù)。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)表示,應(yīng)用Minitab13.3統(tǒng)計軟件,采用單因素方差分析進(jìn)行3組間的比較。2應(yīng)激對海馬nos活性的影響NOS陽性神經(jīng)元分布于腦邊緣系統(tǒng)各部,對照組活性平穩(wěn),但應(yīng)激后NOS活性變化明顯。與對照組比較,應(yīng)激1-3d,單純應(yīng)激組和加強(qiáng)應(yīng)激組大鼠NOS陽性神經(jīng)元數(shù)目在大腦皮質(zhì)、紋狀體、海馬CA3區(qū)、下丘腦室旁核和室周核等部位增多,即NOS活性升高。第4-12d,NOS活性進(jìn)一步升高,除皮質(zhì)外,海馬CA3區(qū)在應(yīng)激第6d,紋狀體尾殼核、室旁核和室周核在應(yīng)激第12d時NOS活性變化顯著(P<0.01)。第13-30d,NOS陽性神經(jīng)元的活性開始逐漸降低,到第30d應(yīng)激單純組和加強(qiáng)組各腦區(qū)NOS活性下降明顯,染色變淺、突起變短,有一些陽性細(xì)胞胞體也開始變小;但與對照組相比仍具顯著差異性(P<0.05)。對于同一時間點(diǎn)而言,與對照組相比,加強(qiáng)應(yīng)激組較單純應(yīng)激組NOS活性變化更為明顯;這可能與加強(qiáng)應(yīng)激組大鼠更持續(xù)處于緊張“恐懼”的心理應(yīng)激狀態(tài)密切相關(guān)(表1)。皮質(zhì)內(nèi)可見中等染色密度的NOS陽性纖維,纖維較細(xì),帶有小的膨體相互編織成網(wǎng)(圖版Ⅰ:1),應(yīng)激后皮質(zhì)變化不明顯。需說明的是,應(yīng)激過程中皮質(zhì)的某些區(qū)域NOS神經(jīng)元有較明顯的增多,如梨狀區(qū)和內(nèi)側(cè)中央前區(qū)等,但從整個皮質(zhì)看,其變化不顯著。這或許是由于皮質(zhì)不同區(qū)域具有不同功能的緣故。海馬CA3區(qū)NOS陽性神經(jīng)元與皮質(zhì)相比差異較大,其密度雖接近于皮質(zhì),但顏色明顯淺淡呈弱陽性,突起短小,陽性纖維遠(yuǎn)較皮質(zhì)稀疏(圖版Ⅰ:2)。應(yīng)激第6d,應(yīng)激加強(qiáng)組海馬內(nèi)NOS陽性神經(jīng)元數(shù)目增多,染色呈中陽性;與對照組相比,有顯著差異性(P<0.01)(圖版Ⅰ:3)。紋狀體尾殼核內(nèi)NOS陽性神經(jīng)元染色深,其陽性纖維比皮質(zhì)更為密集,互相交織成網(wǎng)(圖版Ⅰ:4)。應(yīng)激第12d,應(yīng)激加強(qiáng)組大鼠尾殼核內(nèi)的NOS陽性神經(jīng)元增多;與對照組相比,有顯著差異性(P<0.01)(圖版Ⅰ:5)。下丘腦室旁核陽性神經(jīng)元既有大細(xì)胞,又有小細(xì)胞,著色深淺者皆有(圖版Ⅰ:6),室周核及下丘腦外側(cè)區(qū)僅有幾個NOS陽性神經(jīng)元。應(yīng)激第12d,應(yīng)激加強(qiáng)組大鼠下丘腦室旁核的NOS陽性神經(jīng)元增多;與對照組相比,有顯著差異性(P<0.01)(圖版Ⅰ:7)。應(yīng)激第12d,單純應(yīng)激組大鼠下丘腦室周核的NOS陽性神經(jīng)元增多(圖版Ⅰ:8)。3應(yīng)激對nos活性的影響一氧化氮具有神經(jīng)遞質(zhì)的作用,但過量增多的NO又具有神經(jīng)毒性(金惠銘、孟淑蘭,1997)。介導(dǎo)神經(jīng)損傷的NO來源于NOS陽性神經(jīng)元。實驗結(jié)果表明,應(yīng)激可導(dǎo)致腦邊緣系統(tǒng)NOS陽性神經(jīng)元的表達(dá)增加,即NO的增多,使腦邊緣系統(tǒng)的神經(jīng)元功能受損。在應(yīng)激早期,NOS活性增高,尤其是介導(dǎo)應(yīng)激反應(yīng)的重要腦區(qū)海馬和下丘腦室旁核NOS活性變化明顯。海馬在第6d和室旁核在第12dNOS活性為最高(P<0.01),但隨著應(yīng)激時間的延長其活性和陽性細(xì)胞數(shù)開始逐步減少,這一結(jié)果與金玉祥等結(jié)果相似。金玉祥等(2000)通過足底電擊加噪音刺激應(yīng)激模型觀察了應(yīng)激1d、3d、6d、9d、15d大鼠腦內(nèi)NOS陽性神經(jīng)元的變化,發(fā)現(xiàn)第1d-6d腦內(nèi)NOS活性逐步升高,以第6dNOS活性為最高;之后,其活性下降,到第15d陽性細(xì)胞數(shù)量下降且染色淺淡。有人通過急性束縛應(yīng)激大鼠4h后發(fā)現(xiàn)大鼠下丘腦室旁核NOS陽性神經(jīng)元的NOS活性增強(qiáng)(宋春杰等,1997)。Lezaetal.(1998)報道,在應(yīng)激早期4-9d,鼠腦組織中即有NO的增加,其后9-14d海馬神經(jīng)元受到損害。張艷美等(2002)對強(qiáng)迫游泳(15min/d)4周大鼠的研究發(fā)現(xiàn),其海馬內(nèi)NOS陽性神經(jīng)元表達(dá)增加,NO增多,海馬CA3區(qū)錐體細(xì)胞受到損害。目前的研究認(rèn)為過度生成的NO產(chǎn)生的神經(jīng)毒性作用是應(yīng)激導(dǎo)致腦內(nèi)神經(jīng)元受損的原因之一,本文的結(jié)果支持這一觀點(diǎn)。本實驗中NOS活性變化與其它文獻(xiàn)時程上的差異,可能與應(yīng)激類型、強(qiáng)度和時間的不同所造成的應(yīng)激反應(yīng)程度的不同有關(guān)。在應(yīng)激早期,應(yīng)激刺激激活了興奮性氨基酸受體,使細(xì)胞內(nèi)游離鈣增加,導(dǎo)致NOS活性增強(qiáng)。此外,在應(yīng)激狀態(tài)下,中樞神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)也參與了反應(yīng),使一些神經(jīng)遞質(zhì)和激素水平升高,例如大腦內(nèi)乙酰膽堿、血管緊張素等增高均可激活NOS(Zhu,1996)。NOS活性升高后隨著應(yīng)激時間的延長而下降原因可能如下:(1)應(yīng)激反應(yīng)中,機(jī)體可通過各種復(fù)雜的中樞機(jī)制來減輕應(yīng)激引起的神經(jīng)元的損傷;有研究者認(rèn)為,在神經(jīng)損傷中,神經(jīng)細(xì)胞可通過表達(dá)內(nèi)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(如CNTF,NGF等)來減少NOS陽性神經(jīng)元的表達(dá)進(jìn)而減少NO的生成(陳秀青等,2000);(2)過度生成的NO在損傷其它神經(jīng)元的同時也使NOS陽性神經(jīng)元受到損傷,從而使NOS陽性神經(jīng)元數(shù)目減少(金惠銘等,1997)。應(yīng)激反應(yīng)時,機(jī)體可通過各種代償機(jī)制維持內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定,但過于持久或強(qiáng)烈的應(yīng)激會破壞這種平衡,使機(jī)體受損。近年的研究提示,應(yīng)激超過一定的時程(3-4周以上)則可能導(dǎo)致腦內(nèi)神經(jīng)元受到損害(Bruce,1999;Dumanetal.,1999;Checkley,1996;Magarinosetal.,1995)。作者認(rèn)同這一觀點(diǎn),認(rèn)為捕食應(yīng)激過程中由于NO的過量生成可導(dǎo)致腦邊緣系統(tǒng)神經(jīng)元受損。與應(yīng)激前、中期相比,應(yīng)激第30d應(yīng)激組NOS陽性神經(jīng)元的活性和數(shù)量明顯下降;與對照組相比,其NOS