硫酸西索米星的雜質(zhì)譜研究

硫酸西索米星的雜質(zhì)譜研究

西索米星是20世紀(jì)60年代開發(fā)的第一個含有雙鏈氨基酸的抗生素。它也是一種合成氨基酸并且更有效的母親。氨基糖苷類抗生素也已被用作姐妹劑。它具有良好的療效和低價格特點。其硫酸鹽制劑在臨床上仍得到廣泛應(yīng)用。國外西索米星多由伊尼奧氏小單孢菌發(fā)酵產(chǎn)生;國產(chǎn)西索米星是由伊尼奧氏小單孢菌澄江變種產(chǎn)生。國家食品藥品監(jiān)督管理局網(wǎng)站上顯示,目前我國硫酸西索米星原料有5個廠家生產(chǎn),注射液、注射用粉針等不同劑型有47個生產(chǎn)批文,質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中國藥典、日本藥局方及美國藥典收載,但英國藥典及國際藥典未收載。由微生物發(fā)酵的西索米星樣品為對組分樣品,范明琦等曾從西索米星中分離出6個極性小組分,測定硫酸西索米星中有關(guān)物質(zhì)的方法有薄層色譜、HPLC-ELSD等方法,王建等曾采用HPLC-MSn方法探討硫酸西索米星中有關(guān)物質(zhì)結(jié)構(gòu),可能因流動相中三氟乙酸(0.05mol·L-1)對電噴霧有較強的離子抑制作用,檢測靈敏度很低,從硫酸西索米星樣品中只檢出1個雜質(zhì),Li等通過在流動相中添加部分氨水,改善了檢測靈敏度,但從硫酸西索米星中也只檢出6個雜質(zhì),但對硫酸西索米星雜質(zhì)譜的系統(tǒng)研究報道國內(nèi)外未見,為此,作者在阿米卡星含量測定用的HPLC-ELSD色譜條件基礎(chǔ)上,建立了靈敏度高,操作簡單,適合硫酸西索米星LC-MS分析的堿性流動相色譜系統(tǒng),對硫酸西索米星原料的主要雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行推定,推定方法根據(jù)有無雜質(zhì)對照品情況而異:有對照品的雜質(zhì),通過比較其與對照品的色譜和質(zhì)譜行為來確定結(jié)構(gòu);無對照品的雜質(zhì),通過分析西索米星、奈替米星等類似結(jié)構(gòu)的多級質(zhì)譜行為,總結(jié)出同類物質(zhì)的質(zhì)譜裂解規(guī)律,再通過分析未知雜質(zhì)多級質(zhì)譜,實現(xiàn)對其結(jié)構(gòu)的推定,作者曾采用本思路,對硫酸奈替米星中主要雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了推定。1ag內(nèi)部t公司的紡粘設(shè)備Agilent1100LC/MSDTrap液質(zhì)聯(lián)用儀(美國Agilent公司)。西索米星粗品、硫酸西索米星原料分別由江蘇省不同的生產(chǎn)企業(yè)提供(具體名稱略),奈替米星、西索米星對照品均由中國藥品生物制品檢定所提供,甲醇為色譜純試劑,其余均為分析純試劑。2實驗方法2.1流動相及甲醇b色譜柱:GeminiNXC18(4.6mm×150mm,5μm,美國Phenomnex公司);以水-氨水-冰醋酸(96∶3.6∶0.4)為流動相A,甲醇為流動相B,進(jìn)行梯度洗脫0～15min,5%B;15～16min,5%→15%B;16～25min,15%B;26～27min,15%→30%B;28～40min,30%B;40～41min,30%→40%B;41～50min,40%B;50～51min,40%→50%B;51～60min,50%B;60～61min,50%→5%B;61～70min,5%B;流速:1mL·min-1;柱溫:35℃;進(jìn)樣量:20μL。2.2干燥速度ESI離子源;離子源溫度:350℃;霧化室壓力:275.8kPa;干燥氣流速:9L·min-1;離子掃描范圍:100～900m/z;正離子方式檢測,分流模式進(jìn)樣(分流比為3∶2),采用全掃描一級質(zhì)譜、自動全離子掃描二級質(zhì)譜、手動多級質(zhì)譜3種方式采集奈替米星及有關(guān)物質(zhì)的質(zhì)譜信息。3結(jié)果3.1西索米星和內(nèi)諾米星的質(zhì)量分析行為對電噴霧正離子模式下奈替米星和西索米星的一級和二級質(zhì)譜行為,已有較多的報道,詳細(xì)裂解過程可參考文獻(xiàn)。3.2質(zhì)譜條件測定取硫酸西索米星粗品適量,用水溶解并稀釋制成含西索米星約3mg·mL-1的溶液,分別進(jìn)行一級質(zhì)譜全掃描和二級質(zhì)譜離子全掃描,圖2為LC/MS的總離子流圖,有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果見表1。3.3西索米星降解產(chǎn)物的質(zhì)譜鑒定物質(zhì)1A、物質(zhì)2及物質(zhì)3的[M+H]+m/z均為469,其二級質(zhì)譜一致,均為m/z452,434,366,348,324,308,289,205,187,169,163,155,146,145。文獻(xiàn)報道過慶大霉素A、A1、A3的[M+H]+m/z為469,它們的結(jié)構(gòu)如圖4所示,范明琦等曾從西索米星原料藥中分離得到慶大霉素A1及慶大霉素A組分,這三組分的結(jié)構(gòu)均能合理解釋各碎片離子,裂解途徑如圖3所示,對結(jié)構(gòu)進(jìn)一步的確認(rèn)可能需要采用高分辨質(zhì)譜或制備雜質(zhì)對照品等其他方法。物質(zhì)1B的[M+H]+m/z308,與上述幾慶大霉素A組分脫去A環(huán)降解產(chǎn)物的加氫離子吻合;其二級質(zhì)譜為[M+H]+m/z273,205,187,163,146,用慶大霉素A組分脫A環(huán)降解物各碎片離子均能得到合理解釋,裂解途徑如圖4所示,測定慶大霉素A組分二級質(zhì)譜碎片離子m/z308的三級質(zhì)譜,也與物質(zhì)1B的二級質(zhì)譜一致,證明推測合理,即可將物質(zhì)B歸屬為慶大霉素A的降解物。物質(zhì)4的[M+H]+m/z322,與西索米星脫去A得到的降解產(chǎn)物B+C環(huán)的加氫離子吻合,提示該組分為西索米星失去A環(huán)的降解物,即加洛糖胺(garamine),其二級質(zhì)譜為[M+H]+m/z205,187,163,160,142,118,112各碎片離子均能得到合理解釋,裂解途徑如圖5所示,測定西索米星二級質(zhì)譜碎片離子m/z322的三級質(zhì)譜,也與物質(zhì)3的二級質(zhì)譜一致,證明推測合理,即有關(guān)物質(zhì)4為加洛糖胺。物質(zhì)5的[M+H]+m/z289,與西索米星脫去C得到的降解產(chǎn)物A+B環(huán)的加氫離子吻合,提示該組分為西索米星失去C的降解物,其二級質(zhì)譜為[M+H]+m/z271,254,237,173,163,145,127,109,各碎片離子均能得到合理解釋,裂解途徑如圖6所示,測定西索米星二級質(zhì)譜碎片離子m/z289的三級質(zhì)譜,也與物質(zhì)4的二級質(zhì)譜一致,證明推測合理,證明物質(zhì)5為西索米星脫去C環(huán)得到的降解產(chǎn)物。物質(zhì)6的[M+H]+m/z483,與慶大霉素B的相對分子質(zhì)量吻合,其二級質(zhì)譜為[M+H]+m/z366,349,324,322,307,294,236,205,187,163,160,145,各碎片離子均能得到合理解釋,裂解途徑如圖7所示,方金瑞等發(fā)現(xiàn)小單孢菌可以產(chǎn)生慶大霉素B,旁證該結(jié)構(gòu)推定的合理性,即有關(guān)物質(zhì)6為慶大霉素B。物質(zhì)7的[M+H]+m/z482,與文獻(xiàn)報道的JI-20A的相對分子質(zhì)量吻合,其二級質(zhì)譜為[M+H]+m/z365,347,323,322,205,203,187,163,160,145,各碎片離子均能得到合理解釋,裂解途徑如圖8所示,有關(guān)物質(zhì)7為JI-20A,其結(jié)構(gòu)與慶大霉素B相似,差別在于慶大霉素B的A環(huán)2位上為羥基,而JI-20A的A環(huán)2位上為氨基。物質(zhì)8(tR=18.8min)和物質(zhì)9(tR=24.6min)均為[M+H]+m/z434,比西索米星的[M+H]+m/z448小14,提示結(jié)構(gòu)中比西索米星少1個亞甲基。兩物質(zhì)的二級質(zhì)譜主要碎片一致。碎片離子m/z163為西索米星B環(huán)特征離子,m/z271及254為西索米星A+B環(huán)分別脫水、脫氨的特征離子,可見,物質(zhì)8、物質(zhì)9的A環(huán)和B環(huán)與西索米星相同,由此推斷,物質(zhì)8、物質(zhì)9的C環(huán)上比西索米星的C環(huán)少1個亞甲基,西索米星的C環(huán)的3″、4″位上均有可能脫去甲基,但只從二級質(zhì)譜信息無法指定這兩物質(zhì)的結(jié)構(gòu)歸屬,為此,分別對C環(huán)的特征離子m/z146進(jìn)行3級質(zhì)譜掃描,結(jié)果顯示,物質(zhì)7的m/z146的3級質(zhì)譜中有明顯的脫氨基峰m/z129,而物質(zhì)8的m/z146的3級質(zhì)譜中基峰為m/z128,由此可以確定物質(zhì)8和物質(zhì)9的結(jié)構(gòu),如圖9所示,即物質(zhì)8為3″-氮-去甲基西索米星,物質(zhì)9為4-去甲基西索米星。物質(zhì)10的[M+H]+m/z462,比小諾霉素的[M+H]+m/z464小2,推測其為小諾霉素某個環(huán)中含有雙鍵,其二級質(zhì)譜為[M+H]+m/z444,427,345,327,303,285,268,251,215,186,173,163,160,其中m/z163為小諾霉素的B環(huán)特征離子,m/z303比小諾霉素對應(yīng)的脫去C環(huán)特征離子m/z305小2,推測該雙鍵應(yīng)在A環(huán)上,由西索米星的結(jié)構(gòu)推測該雙鍵可能在4,5位之間,可能的結(jié)構(gòu)如圖10所示,按該結(jié)構(gòu)能解釋二級質(zhì)譜中所有碎片離子,表明該結(jié)構(gòu)推測合理。文獻(xiàn)報道西索米星產(chǎn)生菌橄欖星小單孢菌可產(chǎn)生威替米星的結(jié)構(gòu)吻合,進(jìn)一步用威大米星對照品進(jìn)行驗證,物質(zhì)10一級質(zhì)譜、二級質(zhì)譜及色譜保留時間與威大米星完全一致,表明推測合理,即物質(zhì)10為威大米星。物質(zhì)11的[M+H]+m/z447,比西索米星的[M+H]+m/z448小1,推測其為西索米星類似物,其二級質(zhì)譜為[M+H]+m/z429,412,330,322,312,288,270,253,227,186,173,163,160,142,其中m/z163為西索米星的B環(huán)特征離子,m/z322為西索米星B+C環(huán)的特征離子,推測物質(zhì)11的A環(huán)上比西索米星的A環(huán)少1,提示其環(huán)上的氧原子為氮取代,即西索米星的A環(huán)上唯一的連接糖苷的氧原子可能被氮原子取代,物質(zhì)11可能的結(jié)構(gòu)如圖11所示,該結(jié)構(gòu)能解釋二級質(zhì)譜中主要碎片離子,表明該結(jié)構(gòu)推測合理。物質(zhì)12及物質(zhì)13A的[M+H]+m/z448,與西索米星相同,二級質(zhì)譜裂解途徑也相同,可見它們?yōu)榕c西索米星結(jié)構(gòu)極其相似的同分異構(gòu)體。物質(zhì)13B及物質(zhì)14的一級質(zhì)譜均為[M+H]+m/z544,但二級質(zhì)譜完全不同,對其裂解規(guī)律進(jìn)行分析,與現(xiàn)在能查閱到的氨基糖苷類抗生素?zé)o相似之處,為新發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)。3.4硫酸西索米星的雜質(zhì)組成分別取西索米星對照品、2批硫酸西索米星原料適量,用水溶解并稀釋制成含西索米星約3mg·mL-1的溶液,應(yīng)用建立的HPLC-ESI-IT-MSn分析它們的雜質(zhì)譜,圖12為它們的LC-MS總離子流圖(TIC),結(jié)果顯示,西索米星對照品品中僅檢出西索米星脫去A環(huán)的加洛糖胺,純度較高,1批硫酸西索米星中檢出7個雜質(zhì),另外1批硫酸西索米星原料檢出16個雜質(zhì),采用上述結(jié)構(gòu)分析的思路,各檢出雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)均得到歸屬(詳細(xì)結(jié)果略)。這些分析結(jié)果對生產(chǎn)企業(yè)改進(jìn)發(fā)酵、精制工藝和儲存條件等方面有重要的指導(dǎo)意義。4在含全氟酸流動相中增加鹽水4.1因氨基糖苷類抗生素結(jié)構(gòu)中有很多的氨基和羥基,其在反相色譜柱中幾乎不保留,很多文獻(xiàn)報道通過在流動相添加全氟酸(三氟乙酸、五氟丙酸、七氟丁酸等)改善這類物質(zhì)的色譜分離,因流動相中的全氟酸對質(zhì)譜檢測特別是正離子有強抑制,使得質(zhì)譜中幾乎無信號,有人建議在柱后添加含丙酸或丁酸的丙醇溶液,即所謂的“TFAfix”技術(shù)解決三氟乙酸對質(zhì)譜靈敏度抑制問題,后因其操作復(fù)雜,人們在應(yīng)用過程中逐漸演變?yōu)樵诹鲃酉嘀兄苯犹砑硬糠直峄蚨∷?也有學(xué)者通過在含全氟酸流動相中增加氨水的方法改善靈敏度,在選擇硫酸西索米星雜質(zhì)譜分析的方法時,對上述方法均進(jìn)行了嘗試,結(jié)果顯示,上述4種方法均適用于硫酸西索米星LC/MS分析,并有足夠的靈敏度,但含全氟酸的流動相對質(zhì)譜儀的污染嚴(yán)重,實驗結(jié)束后需要對質(zhì)譜儀進(jìn)行全面清洗,否則嚴(yán)重影響后面品種的質(zhì)譜檢測靈敏度,而作者也曾利用氨基糖苷類抗生素是兩性化合物的特點,采用pH10的堿性流動相,通過LC-MS成功地實現(xiàn)了對研究依替米星、小諾霉素等原料中雜質(zhì)譜的研究,而堿性流動相可以同時解決分離和檢測的問題,而且對儀器沒有污染,優(yōu)于全氟酸的檢測條件。4.2本研究選用電噴霧離子化方法,分別用正、負(fù)離子模式掃描西索米星溶液,結(jié)果顯示,正離子模式下檢測靈敏度超乎想象地遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于負(fù)離子檢測模式,可能是流動相中