家族性低鉀型周期性麻痹基因的篩查

家族性低鉀型周期性麻痹基因的篩查

核電站低鉀周期性麻痹（hypkamase，hyp）是一種正常染色體的顯性遺傳疾病，發(fā)病率為1.105。該病分為家族性和散發(fā)性2型,西方國家以家族性多見,亞洲各國以散發(fā)性多見。其臨床特征為發(fā)作性肌無力伴隨血清鉀濃度降低,肌無力經常涉及四肢,嚴重患者可死于呼吸肌麻痹或血清鉀濃度降低所致的心律失常。近年來,通過遺傳學、分子生物學和電生理學的聯合研究發(fā)現,HOKPP是由離子通道基因突變所致的離子通道病,涉及的離子通道基因主要有CACNA1S、SCN4A、KCNE3(分別編碼骨骼肌電壓門控鈣通道α1亞單位、鈉通道α亞單位和鉀通道輔助亞單位MiRP2)。目前已發(fā)現CACNA1S存在R528H/G、R1239H/G突變(位于外顯子11和30),SCN4A基因存在R669H、R672H/G/C/S突變(位于外顯子12)和P1158S突變(位于外顯子19)。有報道編碼骨骼肌鉀通道輔助亞單位MiRP2基因KCNE3的R83H突變也與HOKPP相關,但此結論尚存在爭議。與CACNA1S突變相關的HOKPP被定義為Ⅰ型,與SCN4A突變相關的HOKPP被定義為Ⅱ型。西方國家統(tǒng)計Ⅰ型HOKPP約占患病人數的69.0%,Ⅱ型約占8.6%,約22.4%沒有找到相關突變。HOKPP不僅具有基因異質性,同時具有表型異質性。不同突變的臨床表型,包括首發(fā)年齡、發(fā)作時血清鉀水平、發(fā)作持續(xù)時間、持久性肌無力的發(fā)生率、性別外顯率、對藥物的反應等都不盡相同。而且,不同種族在突變好發(fā)位點以及相同突變的臨床表型方面也存在差異。我們對中國家族性HOKPP患者進行HOKPP相關候選基因的篩查,旨在明確中國HOKPP的致病基因位點以及基因型和臨床表型的相關性。數據和方法1.發(fā)作性四下肢無力風險為2002—2005年在我院門診和住院部就診的14例有陽性家族史的HOKPP先證者以及其中3例陽性先證者的家系中的4例其他患者和34名健康親屬?；颊呔憩F為發(fā)作性四肢無力伴有血清鉀降低。所有先證者均行血生化、血氣分析、甲狀腺功能、甲狀腺及腎上腺B超、尿常規(guī)等檢查,排除了甲狀腺功能亢進、腎小管酸中毒等繼發(fā)性HOKPP。2.所有患者及其家人均簽署知情同意書，收取三分之一之三的周游世界ml,應用SigmaDNApurificationkit試劑盒提取基因組DNA。3.pcr擴增及活性物質合成CACNA1S基因外顯子11、30,SCN4A基因外顯子12、19和KCNE3基因外顯子1包括了目前已知的可導致HOKPP的相關突變位點。5對引物來源于文獻,利用PCR技術擴增以上3個基因的5個外顯子,引物由奧科生物工程技術公司合成。PCR反應體系25μl,含DNA50ng,引物0.2μmol/L,dNTPs200μmol/L,TaqDNA聚合酶1U(日本TaKaRa公司)。反應條件:在Cetus2400熱循環(huán)儀(美國PE公司)中,變性94℃5min;變性94℃40s,退火溫度由具體引物決定(表1);延伸72℃60s,循環(huán)35次;延伸7min。應用2%瓊脂糖電泳檢測PCR產物的質量,用PCR純化試劑盒(申能博采生物技術公司)純化PCR產物,去除引物及Taq酶。4.使用美國制造的abiprim377DNA測序儀對純化后的PCR產物進行正反向測序,明確有無突變。結果一、家系及性別基因外顯子基因型檢測對14個家系的先證者進行3個基因5個外顯子測序后,發(fā)現3個家系(圖1)中的先證者攜帶HOKPP相關突變:CACNA1S基因的R1239H突變和SCN4A基因R672H突變。其余家系先證者未發(fā)現已知的HOKPP相關突變。進一步對這3個家系中的其他患者和相關親屬進行測序分析,結果如下。1.家系1:3代共11人,其中2例發(fā)病,為先證者及其母親,對其母進行CACNA1S基因外顯子30測序也發(fā)現存在3716G→A雜合突變,引起氨基酸序列改變R1239H(圖2)。對其家系其他成員進行測序,未見此突變,提示此突變?yōu)橥耆怙@率,男女均發(fā)病,無性別差異。2.家系2:3代共17人(獲得其中15人的血液樣本,Ⅱ3、Ⅱ7失訪),其中3例患者均為男性,為先證者及其2位堂兄。測序發(fā)現3例患者SCN4A基因外顯子12上存在2015G→A雜合突變,引起氨基酸序列改變R672H(圖3)。進一步對其家系其他成員測序發(fā)現,此家系另外4人也攜帶此突變但未發(fā)病。其中1名男性,為先證者的弟弟,現年17歲,目前無臨床癥狀,但不排除今后發(fā)病可能。另外3名為女性,分別是先證者的母親、姨母、外祖母,年齡分別是38歲、47歲、73歲,既無發(fā)作性肌無力癥狀,也無持久性肌無力表現。提示此突變?yōu)椴煌耆怙@率,尤其是女性突變基因攜帶者均未發(fā)病。3.家系3:3代共15人,其中2例發(fā)病,均為男性,為先證者及其舅舅。測序發(fā)現2例患者SCN4A基因外顯子12上存在2015G→A雜合突變,引起氨基酸序列改變R672H(圖3)。進一步對其家系其他成員測序,發(fā)現先證者的母親(36歲),也存在相同突變但未發(fā)病。先證者外祖父測序正常,外祖母去世,推測外祖母也攜帶此突變,但未發(fā)病。此家系女性突變基因攜帶者未發(fā)病。二、干預綜合征的臨床特征分析表21.血鉀偏低的治療先證者(Ⅲ2)男性,17歲,首發(fā)年齡為8歲。主要臨床表現為發(fā)作性四肢力弱,嚴重時可累及呼吸肌,一般在夜間睡眠時出現癥狀,持續(xù)時間4～48h后肢體肌力恢復正常,發(fā)作恢復期出現肌肉疼痛,無肌強直。誘因有勞累、受涼、飽食、感染后、精神緊張、秋冬及冬春交界等。8歲時首次發(fā)作1次,12歲開始發(fā)作頻繁,達到35～50次/年。發(fā)作期血鉀偏低(1.5～2.8mmol/L)。給予補鉀和乙酰唑胺治療有效。先證者母親(Ⅱ3)也為HOKPP患者,其臨床特征見表2。2.肌強直和持久神經病先證者(Ⅲ5)為18歲男性,發(fā)病年齡為15歲。表現為發(fā)作性四肢無力,一般在晨起時發(fā)作,持續(xù)2～24h后肢體肌力可恢復正常,無肌強直和持久性肌無力表現。誘因有勞累、受涼、飽食、饑餓、感染后、情緒緊張、飲用碳酸類飲料等。發(fā)作頻率:病初4～6次/年,17歲開始病情加重,100～200次/年。發(fā)作期血鉀2.5～3.4mmol/L(平均2.95mmol/L)。給予補鉀治療可以減輕癥狀,促進恢復。給予乙酰唑胺250mg,3次/d,治療無效。先證者的2位堂兄(Ⅲ2、Ⅲ3)也為HOKPP患者,臨床特征見表2。3.發(fā)作期血鉀偏低、以乙酰胺胺治療先證者(Ⅲ4)為男性,13歲,首發(fā)年齡12歲。一般在睡眠時發(fā)病,持續(xù)時間4～12h后肢體肌力恢復正常。誘因有勞累、受涼、出汗等。發(fā)作頻率:12歲發(fā)作4～5次,13歲開始發(fā)作頻繁,發(fā)作達到30次。發(fā)作期血鉀偏低(2.6mmol/L),尿常規(guī)、肌電圖正常。補鉀治療有效,乙酰唑胺治療無效。其舅舅(Ⅱ7)也為HOKPP患者,臨床特征見表2。4.發(fā)病年齡及治療有效CACNA1SR1239H突變攜帶者,男女均發(fā)病,完全外顯率,發(fā)病年齡在8～9歲,乙酰唑胺治療有效;而SCN4AR672H突變患者均為男性,女性突變基因攜帶者均未發(fā)病,呈不完全外顯率,發(fā)病年齡在15～29歲,乙酰唑胺治療無效。cacna1s基因s1239h突變家系的發(fā)現目前,我國HOKPP家系的研究發(fā)現有2種突變,CACNA1S基因的R528G突變和SCN4A基因R672C突變。我們對我國14個HOKPP家系先證者進行了候選基因的熱點篩查,首次發(fā)現中國HOKPP家系還存在CACNA1S基因R1239H突變和SCN4A基因R672H突變。2種突變患者除具有HOKPP的典型表現外,又各具特點。CACNA1S基因R1239H突變特點為:兒童期發(fā)病,青春期加重,30歲以后病情減輕;乙酰唑胺治療有效;完全外顯率,無性別差異。SCN4A基因R672H突變特點為:青春期發(fā)病,25歲以后病情減輕;乙酰唑胺治療無效;不完全外顯率,女性突變基因攜帶者均未發(fā)病。因此,我們認為CACNA1S基因R1239H突變和SCN4A基因R672H突變的臨床表型存在差異。通過對不同突變位點臨床表型的總結,有助于今后根據臨床表型推斷突變位點,指導治療,判斷預后。2001年日本報道了1個CACNA1S基因R1239H突變家系,我們的研究與其不同之處在于:日本家系患者首發(fā)年齡在3～7歲,而中國患者在8～9歲;日本家系部分患者首次發(fā)病前就有持續(xù)性肌無力表現,而中國患者沒有類似表現。而且,我們觀察到R1239H突變家系女性患者在月經前期易發(fā)作,而妊娠期間無發(fā)作,既往的文獻未見到類似報道。此現象提示女性患者的肌無力發(fā)作可能與體內的雌、孕激素水平有關。但雌、孕激素影響周期性麻痹發(fā)作的機制尚不清楚。2001年Sternberg等對58例法國HOKPP先證者進行研究發(fā)現,5例存在SCN4A基因突變(R672H3例,R672G1例,R672S1例),與我們觀察到的相同之處在于乙酰唑胺對于SCN4A基因突變患者無效;不同之處在于他們觀察到SCN4A基因突變在男性和女性中均為完全的外顯率,而我們發(fā)現4例女性R672H突變攜帶者均未發(fā)病(最小的36歲,最大的73歲),1例男性R672H突變攜帶者也未發(fā)病(目前17歲,不排除今后發(fā)病可能,需要隨診)。因此,根據我們研究的結果,R672H突變存在不全外顯率,與國外報道的不同可能是由于種族差異。文獻報道HOKPP患者男性多于女性,男性約占62%,女性約占38%。HOKPP患者男性多于女性可能是由于HOKPP責任突變在女性的外顯率下降。同時,某些散發(fā)的患者無家族史,也可能是由于不外顯的女性基因攜帶者將責任突變傳給子代,導致子代發(fā)病。與歐洲國家相比,亞洲各國HOKPP患者散發(fā)性多于家族性。我們發(fā)現R672H突變女性攜帶者均未發(fā)病,而Sternberg等觀察到SCN4A基因突變(包括R672H)女性外顯率為100%,我們推測可能由于種族差異,亞洲攜帶突變的女性外顯率較歐洲人更低,造成亞洲散發(fā)性HOKPP明顯多于歐洲,但尚需大樣本驗證。關于女性外顯率低的原因,目前尚不清楚,有人提出HOKPP發(fā)病受多基因影響,并非單基因疾病。也有人提出此病可能是X-連鎖隱性遺傳,具體原因有待進一步研究。我們通過DNA直接測序對14個獨立的HOKPP家系先證者進行了候選基因突變熱點篩查,僅發(fā)現3個家系患者攜帶已知