鼠源單克隆抗體的研究進展

鼠源單克隆抗體的研究進展

自混合腫瘤技術的誕生以來，單克隆抗體對人類疾病的研究起到了重要的推動作用。目前,針對各種物質(zhì)的鼠源單克隆抗體已經(jīng)非常普遍。但鼠源單克隆抗體用于疾病的治療時卻有嚴重的不足,例如:血清中半壽期短;僅有部分不同亞類的抗體能引發(fā)效應功能;最大的障礙是誘發(fā)人抗鼠(HAMA)反應。隨著抗體工程的發(fā)展,利用抗體技術對鼠源抗體進行人源化改造是解決治療用單克隆抗體的有效途徑。尤其是近年來由于抗體庫技術的快速發(fā)展,純粹的人源抗體也可以通過基因工程手段獲得,這可能是未來治療用單克隆抗體的主流。因此筆者就單克隆抗體人源化的有關實驗研究進展進行了綜述。1mcab的人源化克服HAMA反應的2種可能的方法就是使用人源抗體或人源化抗體。由于特異性強、親和力高的人源抗體的基因不易得到,目前主要進行鼠單克隆抗體McAb的人源化。該方法就是在消除鼠源McAb的對人的免疫原性前提下而將其進行改造,使之和人體內(nèi)的抗體分子具有極其相似的輪廓(profile),從而逃避人免疫系統(tǒng)的識別,避免誘導HAMA反應。進行抗體的人源化時應遵循2個基本原則,即保持或提高抗體的親和力和特異性;大大降低或基本消除抗體的免疫原性。目前,雖然人源化有多種方案,但都必須遵循這2個原則,尤其不能喪失抗體特異結(jié)合的能力。2大鼠mca的源化方法2.1鼠單抗的恒常性檢測抗體的恒定區(qū)不僅是決定抗體免疫效應功能的關鍵部位,而且是抗體在體內(nèi)保持較長的半衰期的主要原因。人體中的多數(shù)蛋白質(zhì)分子的半衰期都很短,而抗體分子在體內(nèi)卻相當穩(wěn)定,尤其是IgG(除IgG3之外),其半衰期多達20d,這主要是由于許多組織的細胞表面表達一種IgGFc受體FcγRn,該受體具有調(diào)節(jié)IgG代謝的作用(該受體的另外一種功能是介導IgG通過胎盤)。當完整抗體IgG與細胞表面的受體FcγRn結(jié)合時,就可以免受循環(huán)中的蛋白酶等酶類的降解。抗體的恒定區(qū)是抗體分子結(jié)構(gòu)中免疫原性最強的部位,而決定抗體特異性的是抗體的可變區(qū),且引起人抗鼠抗體反應主要由鼠單抗的恒定區(qū)所致,運用基因工程技術將鼠單抗可變區(qū)與人抗體的恒定區(qū)相拼接,即成為鼠單抗人源化的最簡單形式人/鼠嵌合抗體(chimericantibody)。在嵌合抗體中僅有可變區(qū)為鼠源性,大大降低了鼠源單抗的免疫原性,同時又保留了鼠單抗的高親和性及特異性。因此通過基因工程的手段將鼠源單克隆抗體的恒定區(qū)置換為人源抗體的恒定區(qū)可大大降低抗體在人體應用中的HAMA反應。實驗表明,嵌合抗體既具有鼠源單克隆抗體的特異性抗原結(jié)合能力,又具有人源抗體的免疫介導功能。目前產(chǎn)生嵌合抗體的技術路線比較成熟,現(xiàn)已有多種嵌合抗體被研制出來,部分已作為治療性藥物進入臨床。但由于嵌合抗體保留的鼠源序列較多,在進行臨床試用時能夠被人體的免疫系統(tǒng)所識別產(chǎn)生HAMA。如Khazaeli等研究發(fā)現(xiàn),重復給予嵌合抗體B72.3后,12名腸癌患者中的7人引發(fā)針對鼠源可變區(qū)的人抗鼠抗體反應。故有必要對鼠單抗可變區(qū)進行進一步的人源化。2.2改革共線的抗2.2.1人、鼠間抗體可變區(qū)殘基的同源模建對鼠CDR及FR表面殘基進行鑲飾或重塑,以使之類似于人抗體CDR的輪廓或人FR的型式。表面重塑途徑的一個前提是,鼠McAb可變區(qū)的免疫原性起源于它的表面殘基。因為現(xiàn)在普遍認為,殘基的運動性和溶劑的可及性是其成為抗原決定簇的基本條件,因此表面殘基理應攜帶絕大部分(如果不是全部)的抗原表位。溶液可及性表面殘基的劃分標準是,構(gòu)成該殘基的全部原子的30%以上是溶劑可及的。盡管人、鼠間抗體可變區(qū)表面暴露殘基的精確型式有差別,但大多數(shù)的表面位置的殘基類別有強烈的傾向性,僅僅考慮這種表面型式就可分出抗體可變區(qū)的組別。這說明抗體可變區(qū)表面至少也和框架區(qū)核心一樣保守,表面型式的差別是人鼠間抗體的主要差別。根據(jù)對現(xiàn)有的抗體晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的分析結(jié)果統(tǒng)計,在序列配對位置上,人、鼠間抗體可變區(qū)殘基的相對溶劑可及性分布的保真度達98%。這說明在異種間誘導免疫反應的殘基是由其余的種特異性溶液可及表面殘基引起的。將鼠特異性表面殘基換成人源性的,就可模擬人源抗體的表面輪廓,逃避人體免疫系統(tǒng)的識別,達到人源化的目的。該策略可以不進行同源模建,在序列同源分析的基礎上,選擇與鼠表面殘基暴露類型最相匹配的人源型式進行,但不夠準確。另外,如果要改變的殘基在側(cè)鏈大小、電荷、疏水性,或有可能形成氫鍵從而影響到CDR的構(gòu)象,則不予改變。因為要改變的殘基較少,能減少CDR-FR之間的不相容性。鼠源McAb在人體引起的HAMA反應,究竟是完全由其表面的暴露殘基引起,還是由表面殘基與內(nèi)部殘基的共同貢獻,涉及到抗體產(chǎn)生最基本的免疫學機制,而這種機制仍是目前探討的熱點。盡管有人認為即使在MHC背景下鼠源McAb被加工和提呈后包埋殘基暴露出抗原性,但誘生的抗抗體也只能和降解的或解折疊的原抗體起反應,不會干擾原抗體的治療效應。2.2.2cdr殘基的替代在人FR選擇與CDR有相互作用、與抗體的親和力有密切關系或?qū)R空間結(jié)構(gòu)折疊起關鍵作用的殘基進行改變,以補償完全的CDR移植。立體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)和同源性分析表明:從抗原結(jié)合、穩(wěn)定CDR構(gòu)象、FR折疊這幾個方面而言,構(gòu)成抗體FR的殘基并不具有相同的重要性。以此為依據(jù)將這些殘基分成3類:①低風險性殘基,即暴露于溶劑而對抗原結(jié)合和抗體結(jié)構(gòu)貢獻甚少的殘基。替代這些位置的殘基能降低免疫原性而幾乎不影響抗體的親和力。②高風險性殘基,即直接參與抗原結(jié)合、穩(wěn)定CDR構(gòu)象或FR折疊的殘基。為了保持人源化抗體的活性,應盡量避免在這些位置進行替換。③中度風險性(Moderate-risk)殘基。FR中的高風險性殘基和某些中度風險性殘基,通稱為非CDR區(qū)補充調(diào)控殘基。它們散布于線性序列的不同位置,為每個CDR回折(Loop)提供了合適的“平臺”。其形狀和側(cè)鏈大小協(xié)同決定CDR的基本構(gòu)象,并影響其抗原結(jié)合的特異性。因而將CDR搬到人源FR后,必須將人FR中的這些位置替換成鼠源非CDR區(qū)補充調(diào)控殘基以補償完全的CDR移植。這種分析方法使人源化突變方案具有選擇性和針對性,避免了盲目的可能導致失敗的探索。通過在中度風險性殘基中進行變化,還有可能提高人源化抗體的親和力。不足的是對殘基的分類要以晶體數(shù)據(jù)和三維結(jié)構(gòu)為基礎,才能提供準確的標準。2.2.3在最簡位置模板的選擇上進行人源化人源化McAb保留了鼠源McAb可變區(qū)中參與抗原結(jié)合的氨基酸殘基,包括CDR和FR中的一些關鍵殘基。盡管鼠框架區(qū)的其余部分可以從某個人FR中搬移過來,毫無疑問,這樣得到的人源化抗體序列和人抗體的保守序列(Consensusse-quences)在一些位置上有差別。這些來源于個體型抗體親和力成熟過程中體細胞突變的非典型殘基,應用于病人后會誘導免疫反應。因此,理想的途徑是,以人FR保守序列為模板進行人源化。由于人抗體輕、重鏈可變區(qū)不同亞類的保守序列并不相同,需要一種合適的方法來尋找最適保守序列。最簡位置模板(Minimalpositionaltemplate)表明,抗體可變區(qū)中哪些位置絕對需要保持抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的完整性,提供了確定關鍵位置的方法。在選擇人框架區(qū)時,首先從現(xiàn)有的人源抗體保守序列中搜尋與鼠框架區(qū)最類似的序列;其次根據(jù)最簡位置模板確定鼠可變區(qū)的關鍵位置殘基;最后保留所有這些位置而將其余部分進行人源化。Couto等首先利用計算機模建和實驗探索找到一個最簡模板。以此模板對抗乳腺表皮抗原BA46的抗體Mc3成功地進行了人源化。2.3采用氨基乙烯技術對大鼠進行抗人源化噬菌體抗體庫技術的問世,為鼠單抗的人源化提供了新的方法。由于抗體庫具有對多樣化抗體的強大篩選能力,可以從2方面用于鼠單抗的人源化。2.3.1人源化抗體的篩選在進行抗體人源化過程中,除移植CDR外,還需移植部分在抗原結(jié)合過程中起重要作用的骨架區(qū)的殘基。盡管通過立體構(gòu)象分析和分子模建有助于這些骨架區(qū)殘基的確定,但其最終的確定往往需要構(gòu)建多種抗體的突變體,反復測試。用抗體庫方法可在候選骨架區(qū)殘基的位置同時引入鼠源副本及人源副本,構(gòu)建組合抗體庫,通過高效篩選過程尋找最佳組合,獲得高親和力的人源化抗體。Baca等在對抗VEGF鼠單抗進行人源化時發(fā)現(xiàn),單純CDR移植獲得的人源化抗體的親和力與相應的嵌合抗體相比,降低了4000倍。進一步分析發(fā)現(xiàn)骨架區(qū)中13個殘基可能在抗原結(jié)合過程中起重要作用。將這13個殘基進行隨機化后構(gòu)建噬菌體抗體庫,通過8輪篩選獲得了親和力提高125倍的人源化抗體。2.3.2基于人源可變區(qū)基因庫配對的人源抗體篩選這是在噬菌體抗體庫技術基礎上發(fā)展起來的新的鼠單抗人源化策略,1994年由Jespers等首先提出。其基本原理是以鼠單抗為模板,利用噬菌體表面選擇體系,篩選出與親本鼠單抗識別相同抗原表位的完全人源抗體?；疽c為:克隆鼠單抗基因,以鼠單抗輕鏈或重鏈可變區(qū)基因與多樣性的人重鏈或輕鏈庫基因組合,形成雜合抗體庫,用相應的抗原從中篩選有結(jié)合活性的人—鼠雜合抗體,再用雜合抗體中的人源可變區(qū)基因與另一條鏈的人源可變區(qū)基因庫配對,篩選出完整的人可變區(qū)基因。該方法操作簡單,能夠獲得完全人源抗體。王卓智等曾運用該方法對抗TNF-α鼠單抗進行人源化,雖獲初步成功,但也體會到由于完全脫離鼠單抗的基因序列,所獲人源單抗的特異性和親和力難以得到保證,甚至有時所獲的人源抗體與抗原的結(jié)合活性會產(chǎn)生漂移,與親本鼠單抗有所不同。為此,Rader等對該方法進行了改良,在抗原定向選擇方法中,以親本鼠單抗的CDR3區(qū)基因替換所用的人抗體庫中的CDR3,構(gòu)建了含親本鼠單抗CDR3基因的人源化噬菌體抗體庫,再通過與鼠單抗親本抗體配對,依次進行鏈替換,篩選到與親本鼠單抗識別同一抗原表位的抗人整合素αγβ3人源抗體。由于CDR3區(qū)是決定抗體特異性的關鍵部位,其巨大的多樣性使本身不具有明顯的種屬特異性,通過引入鼠單抗CDR3序列,可在不影響其人源性的情況下增加其模擬親本鼠單抗的能力,更易于篩選到與親本鼠單抗識別同一抗原表位的人源抗體。因此CDR3導引的抗原表位定向選擇法進行鼠單抗人源化可能成為一種有效的方法,但該方法能否普遍應用,有待進一步驗證。3vifigin在實體瘤治療前的臨床試驗近幾年美國FDA批準的新藥中,工程抗體占很大比例,目前已有100多種人源化單抗進行了臨床試驗,其中數(shù)十種抗體相關新藥得到了應用,其中MedImmune公司研制的抗-αγβ3人源化抗體Vitaxin在治療