伴皮質(zhì)下梗死和白質(zhì)腦病的常染色體感染性多發(fā)性腦動(dòng)脈病家系中的不典型病例分析

伴皮質(zhì)下梗死和白質(zhì)腦病的常染色體感染性多發(fā)性腦動(dòng)脈病家系中的不典型病例分析

腦血管疾病是威脅人類(lèi)健康的三種疾病之一。發(fā)病率僅占該病的一小部分（<10%）。皮質(zhì)下動(dòng)脈硬化疾病和白質(zhì)腦病的常染色體顯性腦動(dòng)脈疾?。╟erebolstatisticalco起源，omim125310）是近年來(lái)的熱點(diǎn)。CADASIL多在中年發(fā)病,臨床特征為反復(fù)發(fā)作的缺血性卒中、偏頭痛、精神異常和皮質(zhì)下癡呆。磁共振成像(MRI)檢查示多灶性皮質(zhì)下梗死及白質(zhì)腦病。病理改變?yōu)槟X深部多發(fā)的腔隙梗死和白質(zhì)腦病,以及小動(dòng)脈中層平滑肌細(xì)胞表面顆粒性電子致密嗜鋨顆粒物質(zhì)(GOM)的沉積。這些特征性的病理改變是診斷CADASIL的金標(biāo)準(zhǔn)。該病的遺傳缺陷被定位于染色體19p13.2-13.1的NOTCH3基因上。迄今為止,國(guó)外已經(jīng)報(bào)道了約400個(gè)家族,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)超過(guò)50種突變。最常見(jiàn)的突變位于第3和4外顯子中。本病在高加索人種中患病較多,最近幾年在我國(guó)和日本也有報(bào)道,我們最近收集到4個(gè)國(guó)內(nèi)CADASIL家系,現(xiàn)報(bào)道他們的主要臨床特點(diǎn)和基因檢測(cè)的結(jié)果。對(duì)象和方法一、臨床表現(xiàn)及臨床癥狀4個(gè)先證者分別來(lái)自4個(gè)不同的家系,他們的臨床表現(xiàn)、影像學(xué)改變以及病理結(jié)果均符合CADASIL的診斷。家系1、3祖籍山西,家系2祖籍黑龍江,家系4祖籍北京。家系圖見(jiàn)圖1,每個(gè)家系中患病成員的簡(jiǎn)況見(jiàn)表1。先證者1,男,38歲,自37歲起出現(xiàn)間斷頭暈、言語(yǔ)不清、走路不穩(wěn),并逐漸出現(xiàn)應(yīng)答不切題,記憶力明顯下降。既往有飲酒史15年。神經(jīng)系統(tǒng)檢查示記憶力尤其是近記憶力明顯減退,計(jì)算力和理解力差,定向力尚可。四肢肌力正常,右下肢共濟(jì)運(yùn)動(dòng)差,雙側(cè)病理征(-),家系圖見(jiàn)1a。先證者2,女,47歲,44歲開(kāi)始出現(xiàn)頭暈,右側(cè)上下肢無(wú)力,走路不穩(wěn),頭顱CT顯示多發(fā)性腦梗死,經(jīng)治療遺留右側(cè)肢體稍力弱。此后因相似的癥狀復(fù)發(fā)3次住院治療,并逐漸出現(xiàn)手足麻木。患者無(wú)高血壓、高血脂、心臟病、糖尿病史。體格檢查:構(gòu)音障礙,計(jì)算力和近記憶力差,雙眼向左、右及上視均可見(jiàn)眼球震顫。四肢末梢性痛覺(jué)減退,左上下肢輕癱,左側(cè)共濟(jì)運(yùn)動(dòng)欠穩(wěn)準(zhǔn)。四肢腱反射活躍,雙側(cè)踝陣攣(+),四肢病理征(+),家系圖見(jiàn)1b。先證者3,女,39歲,8個(gè)月前出現(xiàn)頭暈伴惡心、嘔吐,在外院診斷為“腦梗死”,治療后頭暈癥狀好轉(zhuǎn),此后間斷頭暈發(fā)作。3個(gè)月前,勞累后出現(xiàn)左頭部脹痛,伴惡心。既往體健。入院后一般內(nèi)科查體及神經(jīng)系統(tǒng)檢查未見(jiàn)異常,家系圖見(jiàn)1c。先證者4,女,44歲,自41歲始出現(xiàn)反復(fù)發(fā)作性缺血性卒中,表現(xiàn)為發(fā)作性眩暈和/或左側(cè)肢體無(wú)力,血壓波動(dòng)性升高3年。無(wú)冠心病和糖尿病史。近1年出現(xiàn)智力減退。有關(guān)這個(gè)家系的臨床特點(diǎn)已作過(guò)報(bào)道,家系圖見(jiàn)1d。4例先證者的腦MRI均可見(jiàn)雙側(cè)基底節(jié)、腦干等部位的多發(fā)性腔隙性低密度灶,以及腦室旁白質(zhì)廣泛脫髓鞘改變。對(duì)4例先證者進(jìn)行腓腸神經(jīng)活檢,均發(fā)現(xiàn)小動(dòng)脈壁平滑肌細(xì)胞變性,其表面出現(xiàn)大量的GOM。對(duì)先證者1同時(shí)進(jìn)行腓腸肌活檢,在肌纖維內(nèi)發(fā)現(xiàn)線粒體內(nèi)類(lèi)結(jié)晶包涵體。二、pcr反應(yīng)及測(cè)序1.鹽析法提取患者外周血基因組DNA,酚/氯仿法提取肌肉組織基因組DNA。2.聚合酶鏈反應(yīng)(PCR):引物覆蓋了NOTCH3基因編碼區(qū)的外顯子1~12及其兩旁的內(nèi)含子序列(表2)。反應(yīng)體系:25μlPCR反應(yīng)體系中含引物各0.2μmol/L,dNTP各100μmol/L,Tris-HCl10mmol/L,KCl50mmol/L,Mg2+1.5mmol/L,0.1%TritonX-100,Taq酶1U,DNA模板50~100ng。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5min,94℃變性45s,56℃退火45s,72℃延伸45s,共30個(gè)循環(huán),最后1個(gè)循環(huán)于72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后,以1.5%瓊脂糖凝膠(內(nèi)含0.5μg/ml的溴化乙啶)電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。3.PCR成功后,再擴(kuò)增100μlPCR產(chǎn)物,純化后,送北京奧科生物有限公司用ABI373型DNA全自動(dòng)測(cè)序儀測(cè)序。對(duì)發(fā)現(xiàn)的突變?cè)龠M(jìn)行反向測(cè)序證實(shí)。tch3蛋白質(zhì)突變PCR產(chǎn)物直接測(cè)序的結(jié)果證實(shí)4個(gè)先證者均存在NOTCH3基因的雜合性突變,且突變位點(diǎn)各不相同。先證者1、2和3的突變位于外顯子3,分別為268C→T、322C→T和328C→T突變(核苷酸的位置從翻譯起始密碼子ATG的A算起),造成Notch3蛋白質(zhì)的突變分別為R90C、C108R和R110C;先證者4的突變位于外顯子11為1819C→T,造成R607C(圖2)。這4種突變均經(jīng)正、反向測(cè)序證實(shí)。因?yàn)橄茸C者2的C108R突變?yōu)槲墨I(xiàn)尚未報(bào)道的新的突變,此突變產(chǎn)生限制性內(nèi)切酶NaeⅠ的新的酶切位點(diǎn),故用PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)對(duì)50名正常人DNA進(jìn)行突變篩查,均未發(fā)現(xiàn)有此突變。對(duì)家系2和4的部分成員也進(jìn)行了NOTCH3基因的突變檢查。先證者2的母親(Ⅲ7)攜有C108R突變;其哥(Ⅳ7)及其父親表型正常,也無(wú)此突變;然而先證者之子(Ⅴ1)現(xiàn)年18歲,雖然表型正常,卻攜有C108R突變(圖3)。在家系4中,先證者4的三姐(Ⅲ4)的頭顱CT顯示丘腦梗死,她也有雜合性的R607C突變;而先證者的五姐(Ⅲ6)無(wú)此突變也無(wú)本病的癥狀。h蛋白質(zhì)受體家族這4例先證者均經(jīng)過(guò)腦外組織活檢發(fā)現(xiàn)小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的胞膜表面出現(xiàn)典型的GOM而證實(shí)CADASIL的診斷。對(duì)先證者及其親屬基因突變的檢測(cè)發(fā)現(xiàn),這4個(gè)CADASIL家系的患者中都有NOTCH3基因的雜合性突變,符合顯性遺傳的特征,從基因水平進(jìn)一步證實(shí)了該病的診斷。這4個(gè)家系的突變各不相同,有3個(gè)家系位于外顯子3,1個(gè)位于外顯子11,所以外顯子3也是中國(guó)CADASIL患者的突變熱區(qū)。這4種突變中R90C、R110C和R607C已被報(bào)道,C108R則為新的突變類(lèi)型,前3種基因突變使堿性氨基酸的精氨酸變?yōu)楹虬被岬陌腚装彼?而第4種突變則造成半胱氨酸替換為精氨酸,所以這4種突變均導(dǎo)致蛋白質(zhì)的性質(zhì)發(fā)生很大的改變,即它們都是致病性的突變,由此引起這4個(gè)家系中的CADASIL。NOTCH3基因編碼一種兼有受體和信號(hào)傳導(dǎo)功能的跨膜蛋白質(zhì),屬于NOTCH蛋白質(zhì)受體家族的一員,進(jìn)化上高度保守,結(jié)構(gòu)上可以分為胞外的34個(gè)表皮生長(zhǎng)因子樣重復(fù)序列和胞漿中的6個(gè)錨蛋白重復(fù)序列,前者與配體結(jié)合,后者介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo),在細(xì)胞分化中起著重要作用。報(bào)道的已超過(guò)50種突變。95%為錯(cuò)義突變,絕大部分與半胱氨酸有關(guān),突變?cè)斐梢粋€(gè)半胱氨酸改為其他氨基酸,或者其他氨基酸變?yōu)榘腚装彼?這與我們報(bào)道的結(jié)果一致。這些突變均發(fā)生于表皮生長(zhǎng)因子樣重復(fù)序列內(nèi),半胱氨酸殘基的產(chǎn)生或丟失導(dǎo)致表皮生長(zhǎng)因子樣重復(fù)序列內(nèi)產(chǎn)生奇數(shù)的半胱氨酸殘基,打破了原有正常的二硫鍵的形成,改變了蛋白質(zhì)的構(gòu)象,影響受體-配體之間的相互作用;或者導(dǎo)致同型二聚體或異型二聚體在血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)的堆積,造成血管平滑肌細(xì)胞的變性。Notch信號(hào)傳導(dǎo)通路還與線粒體呼吸鏈的電子傳遞有關(guān),在先證者1的肌纖維內(nèi)發(fā)現(xiàn)線粒體結(jié)構(gòu)的異常,提示Notch3蛋白質(zhì)的突變可能影響線粒體的功能。這4個(gè)家系的患者中,缺血性腦血管病都主要累及椎基底動(dòng)脈系統(tǒng)(選擇性的后循環(huán)受累),智能損害較早而且突出,個(gè)別成員僅表現(xiàn)為進(jìn)行性癡呆。亞洲其他國(guó)家報(bào)道的患者也是以卒中和癡呆為主要的臨床表現(xiàn),缺乏偏頭痛,這與歐美國(guó)家報(bào)道的臨床表現(xiàn)不完全相同。這些臨床表現(xiàn)規(guī)律在種族之間的差異可能不是NOTCH3突變類(lèi)型不同造成的。因?yàn)?首先我們報(bào)道的這4個(gè)家系,有3個(gè)家系的突變類(lèi)型與其他文獻(xiàn)報(bào)道的相同;其次,這4個(gè)家族雖然存在NOTCH3基因的不同位點(diǎn)突變,但臨床表現(xiàn)相似。所以,我們推測(cè)其他基因也可能影響該病的臨床表型。NOTCH3基因在CADASIL的發(fā)病過(guò)程中的重要性已經(jīng)得到公認(rèn),但是其確切的發(fā)病機(jī)制至今尚未明確。在成人,Notch3受體特異性表達(dá)于血管平滑肌細(xì)胞,而NOTCH3基因突變不影響Notch3的表達(dá)和蛋白質(zhì)裂解,這說(shuō)明基因突變所致的血管平滑肌細(xì)胞的變性可能在CADASIL的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。免疫組織化學(xué)方法證實(shí)CADASIL患者的Notch3受體細(xì)胞外片段在血管平滑肌細(xì)胞膜上出現(xiàn)大量聚積,與GOM鄰近但并不在GOM內(nèi)。CADASIL平滑肌的改變和其他腦小動(dòng)脈病(腦類(lèi)淀粉血管病、Binswanger病)一樣,最后導(dǎo)致腦小血管玻璃樣變性和膠原纖維成分的改變以及血管活性的下降,血液動(dòng)