血友病a患者及家系中基因倒位的間接診斷

血友病a患者及家系中基因倒位的間接診斷

血友?。╤a）是對患者的健康和生命威脅最大的遺傳因素之一。其遺傳規(guī)律為X連鎖隱性遺傳。目前對本病尚無有效根治方法,因此開展基因診斷、攜帶者檢出,以及產(chǎn)前基因診斷,是防止新的患兒出生、阻斷有害基因傳遞的有效措施。但FⅧ基因相當(dāng)大,由26個(gè)外顯子和25個(gè)內(nèi)含子組成,全長達(dá)186kb。已知HA中的一半為重型,而重型HA中,約有40%～50%是由于發(fā)生在FⅧ基因22內(nèi)含子中的倒位所致。已有報(bào)道用長距離PCR(LD-PCR)技術(shù)可以快捷、靈敏地查出這種基因倒位,這樣約四分之一的家系可直接用此技術(shù)作出基因診斷、攜帶者檢出及產(chǎn)前診斷。除此之外導(dǎo)致約70%～80%的血友病A的Ⅷ因子(FⅧ)基因突變呈高度異質(zhì)性,因此完全靠直接查找其基因突變的直接診斷方法,工作量很大、時(shí)間長。我們運(yùn)用3項(xiàng)以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的基因連鎖分析方法進(jìn)行間接診斷,以期為所有的HA家系成員都能作出基因診斷。本文報(bào)道運(yùn)用上述方法查出7例FⅧ基因倒位,并完成19個(gè)非倒位HA家系基因診斷的結(jié)果。對象和方法一、病例選擇選擇源于省域26例HA患者及數(shù)目不等的家系成員分別來自北京、天津、江蘇、湖北、四川、山東、廣西、廣東、福建等地,均經(jīng)省市級以上醫(yī)院確診。患者均為男性,年齡從1歲至73歲不等。家系成員中有患者的姐妹、兄弟、妻子、女兒、外孫女等。每人取3～5ml靜脈血,乙二胺四乙酸或酸性檸檬酸葡萄糖溶液B抗凝,鹽析法抽提基因組DNA,部分采用酚/氯仿法抽提。二、方法1.ycartgradint983/損害賠償/雙循環(huán)擴(kuò)增ycarli1在0.2ml薄壁反應(yīng)管內(nèi),按文獻(xiàn)的方法加入PCR混合物,于梯度PCR儀(RobocyclerGradient96)上進(jìn)行擴(kuò)增,循環(huán)條件為:94℃12s,65℃15min,共30個(gè)循環(huán),在后20個(gè)循環(huán)中,每一循環(huán)的65℃延伸時(shí)間延長20s。擴(kuò)增后進(jìn)行1×TBE配制的0.6%瓊脂糖凝膠電泳,EB染色后用凝膠呈像儀觀察,分析結(jié)果。2.pcr擴(kuò)增條件用于BclⅠ多態(tài)性分析的引物根據(jù)FⅧ外顯子18和內(nèi)含子18基因序列自行設(shè)計(jì):P1:5′TTCATTTCAGTGGACATGTG3′,P2:5′CCTATGGGATTTGAGATGGT3′。擴(kuò)增片段長度為374bp,含有BclⅠ酶切位點(diǎn)的片段經(jīng)BclⅠ酶切后長度為211bp和163bp,不含BclⅠ酶切位點(diǎn)的片段經(jīng)BclⅠ酶切后長度仍為374bp。在25μl體系中,含基因組DNA0.1μg,引物P1和P2各0.4μmol/L,dNTP100μmol/L,1×buffer,TaqDNA聚合酶0.5U。按以下條件進(jìn)行擴(kuò)增:預(yù)變性94℃2min,94℃40s,60℃40s,72℃40s,30個(gè)循環(huán)后,72℃延伸5min。取PCR產(chǎn)物5μl進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳,觀察到DNA擴(kuò)增的特異片段后,取PCR產(chǎn)物5μl,用BclⅠ酶10U,50℃保溫4h,酶解產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳,確定酶切位點(diǎn)的有無,進(jìn)行連鎖分析。3.引物和擴(kuò)增方法參考以家系各成員的基因組DNA0.1μg為模板,所用引物和擴(kuò)增方法參考文獻(xiàn)。取PCR產(chǎn)物5μl進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳,EB染色后用凝膠呈像儀觀察擴(kuò)增片段,進(jìn)行連鎖分析。4.顯色條帶的制備參照Lalloz法,但我們沒有采用放射性標(biāo)記法,而是用銀染法和EB染色法。銀染的主要步驟為:電泳結(jié)束后,將凝膠浸入固定液(10%乙醇、0.5%乙酸)中置搖床上慢速搖動15min,棄去固定液,換染色液(0.2%硝酸銀)置搖床上染色10min,棄染色液,以蒸餾水漂洗兩次,每次1min,然后加入顯色液(1.5%氫氧化鈉、0.4%甲醛)顯色至條帶清晰,及時(shí)終止顯色。EB染色同常規(guī)操作。用凝膠成像儀照相或干膠保存。公正診斷家系1.16個(gè)重型血友病A家系FⅧ基因倒位的檢測:在16個(gè)重型血友病A患者中查出7個(gè)具有FⅧ基因倒位,占43.8%。其中14個(gè)DNA標(biāo)本LD-PCR產(chǎn)物電泳分析的圖譜中,標(biāo)本1、2、3、7、8、10、11、14只出現(xiàn)12kb帶,為野生型,即非基因倒位;標(biāo)本4、9、12只出現(xiàn)一條11kb帶,這說明這3位男性患者的FⅧ基因有倒位;標(biāo)本5、6、13有11kb、12kb兩條帶,此3例是該基因倒位的女性攜帶者(圖1)。2.用BclⅠPCR/RFLP法對19個(gè)非倒位HA家系基因進(jìn)行分析的結(jié)果:家系8先證者基因型為374/-,其母為374/211,由遺傳規(guī)律可知先證者母親的374bp片段與HA致病基因連鎖。先證者之大姐基因型為374/211,其374bp來自母親的致病性FⅧ基因連鎖片段,故診斷其大姐為攜帶者。先證者的二姐基因型為211/211,診斷為正常人(圖2)。用該試驗(yàn)可以對16個(gè)家系作出診斷,可診斷率為84.2%。3.用與FⅧ緊密連鎖的St14/VNTR對19個(gè)非倒位HA家系進(jìn)行基因分析的結(jié)果:家系15先證者及其母的基因型分別為-/700和1300/700,判斷700bp片段與HA致病基因連鎖。先證者之大妹基因型為1300/700,故大妹診斷為HA攜帶者;而小妹(1300/1300)為正常人(圖3)。用該試驗(yàn)可以對其中17個(gè)家系作出診斷,可診斷率達(dá)89.5%。4.用二核苷酸重復(fù)序列多態(tài)性對19個(gè)非倒位HA家系基因進(jìn)行分析的結(jié)果:家系18擴(kuò)增產(chǎn)物在10%(A)和12%(B)的聚丙烯酰胺凝膠電泳,得出的兩組多態(tài)性結(jié)果見圖4。先證者內(nèi)含子22中為(GT)19(AG)7,重復(fù)數(shù)為26,該位點(diǎn)基因型為26/-,由電泳圖得知先證者女兒該位點(diǎn)基因型為26/26,根據(jù)遺傳規(guī)律可知女兒為攜帶者,外孫女為26/25,但由于女兒是純合子,無法判斷外孫女是否攜帶者。先證者內(nèi)含子13中為(CA)21,基因型為21/-,其女兒為21/20,外孫女為21/21,根據(jù)遺傳規(guī)律可知女兒的21拷貝帶與致病基因連鎖,外孫女的兩條21拷貝帶中一條來自母親的致病基因連鎖帶,故外孫女也為攜帶者。用此項(xiàng)試驗(yàn)可以為其中13個(gè)家系作出診斷,可診斷率為68.4%。5.用BclⅠPCR/RFLP技術(shù)對19個(gè)HA家系進(jìn)行連鎖分析的結(jié)果:除家系6、15、18外,其余家系均能作出診斷,可診斷率為84.2%;運(yùn)用二核苷酸重復(fù)序列多態(tài)性可診斷率為68.4%,家系9、10、12、16、19不能作出診斷;而運(yùn)用VNTR/PCR可診斷率為89.5%,只有家系9、14不能作出診斷。可見,聯(lián)合運(yùn)用BclⅠPCR/RFLP與另二種間接診斷方法之一即可對19個(gè)非倒位HA家系全部作出診斷。間接診斷技術(shù)根據(jù)Ⅷ因子活性水平及癥狀可把HA分為重型、中型和輕型,其中重型約占50%。在HA中,由Ⅷ因子基因倒位引起的約占40%～50%。這樣約25%的HA是由Ⅷ因子基因倒位引起。本實(shí)驗(yàn)室建立了直接診斷倒位引起的重型HA的LD-PCR技術(shù)。該技術(shù)代替了國際上的Southernblod雜交技術(shù),大大簡化了步驟,省時(shí)、省力、結(jié)果準(zhǔn)確可靠。本實(shí)驗(yàn)的16個(gè)重型HA家系中共檢出7個(gè)有FⅧ基因倒位,占43.8%,并檢出10位女性攜帶者。但其他導(dǎo)致HA的FⅧ基因突變高度異質(zhì),這使得直接檢出所有突變基因變得繁瑣,成本高。我們采用了3種間接診斷技術(shù),即BclⅠRFLP分析,St14VNTR及二核苷酸重復(fù)序列多態(tài)性分析技術(shù),分別對19個(gè)非倒位HA家系進(jìn)行連鎖分析及診斷。BclⅠ是位于FⅧ基因內(nèi)的一個(gè)多態(tài)性位點(diǎn),用Kogan等的方法擴(kuò)增片斷為142bp,經(jīng)BclⅠ酶切后含酶切位點(diǎn)的變?yōu)?9bp,由于片斷較短,必須進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳才能分析結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)自行設(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增片斷及酶切片段為374/211bp,經(jīng)調(diào)整PCR條件,擴(kuò)增條帶強(qiáng),特異性好,直接用2%瓊脂糖凝膠電泳即可分析結(jié)果,經(jīng)濟(jì)、省時(shí)。在本組19個(gè)家系中可診斷率達(dá)到84.2%,可提供可靠的診斷結(jié)果。St14/VNTR的實(shí)驗(yàn)步驟較BclⅠ更簡便,只需PCR,不需酶解,電泳分析結(jié)果非常清晰,其雜合率較高,提供的多態(tài)信息量(PIC)也高,本組中19個(gè)家系的可診斷率為89.5%。但由于該位點(diǎn)位于FⅧ基因以外,有5%的重組率,故作出診斷時(shí)要小心,最好有其他指標(biāo)佐證以防誤診。二核苷酸重復(fù)序列多態(tài)性發(fā)現(xiàn)較晚,分別位于FⅧ基因內(nèi)含子13和22中,其二核苷酸重復(fù)序列拷貝數(shù)變異較多,提供的多態(tài)信息量可達(dá)70%～80%。本組在19個(gè)家系中運(yùn)用二核苷酸重復(fù)序列多態(tài)性為13個(gè)家系作出診斷,可診斷率為68.4%。通過對HA家系進(jìn)行基因診斷的幾種方法,我們認(rèn)為對HA,首先應(yīng)用LD